高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物及氨基甲酸乙酯關系的研究

周韓玲，安明哲，趙 東，喬宗偉，廖勤儉，郭 艷，李楊華

（宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又稱尿烷，是一種具有遺傳毒性且多位點致癌的化合物。2007年，世界衛生組織的國際癌癥機構將EC歸為2A類致癌物[1-2]。EC廣泛存在于發酵食品和飲料酒中[3-4]，其中，飲料酒中EC含量較高[5-6]。飲料酒中EC的形成途徑主要有兩種：①酸性環境下，由原料帶入及L-精氨酸經酵母菌代謝所產生的尿素與乙醇反應生成EC[7-8]；②生氰糖苷經酶解或熱裂解生成氰醇，氰醇進一步分解生成氫氰酸，氫氰酸在Cu（II）的催化下（無催化劑Cu（II）且酸性條件下反應較慢）生成氰酸鹽，最終與乙醇反應生成EC[9-10]。

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾而制成的飲料酒[11-12]。因釀造原料、生產工藝等原因，白酒中含有一定量的EC[13-14]。加拿大、捷克和日本等國家針對蒸餾酒中EC制訂的限量標準為150 μg/L，EC已成為我國白酒走向國際化的技術壁壘之一。如何降低白酒中EC含量，提高產品品質，打破貿易壁壘并走向國際化，是行業面臨的共性問題[15-16]。

白酒中EC生成機理復雜，高曉娟等[17]研究了清香型白酒貯存過程中EC的變化規律，結果表明，在發酵、蒸酒過程中只有少量的EC形成，清香型白酒中EC急劇增加的環節是貯存階段。張順榮[18]研究了不同香型原酒貯存過程中EC、氰化物和尿素的含量，并采用同位素示蹤法研究了原酒貯存期間EC形成的主要前體，結果表明：白酒貯存過程中EC形成的主要前體物是氰化物。白酒釀造的重要原料高粱是一種含生氰糖苷的作物，生氰糖苷在高粱中以蜀黍氰苷的形式存在[19]，高粱中的蜀黍氰苷經β-葡萄糖苷酶水解或者高溫酸解之后生成β-D-葡萄糖和不穩定的對羥基-（S）-扁桃腈，對羥基-（S）-扁桃腈在內源性α-羥基裂解酶或堿性條件下分解生成對羥基苯甲醛和氰化物，因沸點較低，在蒸酒過程中，氰化物極易進入到酒體中[20-23]。

作為中國三大主要香型白酒之一，濃香型白酒具有窖香濃郁、綿甜醇厚、協調爽凈等特點[24]，是市場占有率最高、消費人群最多的白酒[25]。本研究通過水解試驗、模擬蒸酒試驗和釀酒試驗，探究高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物、EC之間的關系。旨在從原料控制角度探討濃香型白酒中氰化物、EC的控制方法，為白酒生產企業降低酒體中EC含量、提高產品質量安全水平、應對國際食品安全發展形勢提供理論基礎和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯（99%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；D5-氨基甲酸乙酯（98%）、蜀黍氰苷（95%）：美國Sigma-Aldrich公司；水中氰標準溶液（CN-質量濃度為50 mg/L）：中國計量科學研究院；正己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）、乙酸鋅（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醚（色譜純）、磷酸、酒石酸、氫氧化鈉、氯胺T（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司。

高粱樣品（編號為S1～S10），S1高粱：產地為中國西南地區，S2～S4高粱：產地為中國西北地區，S5～S8高粱：產地為中國東北地區，S9～S10高粱：產地為澳大利亞；五糧濃香型白酒出窖糟醅、糠殼、中高溫大曲：宜賓地區某酒廠提供。

1.2 儀器與設備

7890A型氣相色譜儀、7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；ExionLC-5500型三重四級桿液相色譜-質譜聯用儀：美國AB Sciex公司；DMA 35型手持式密度計：奧地利安東帕公司；SBEQ-CG1012型固相萃取裝置：上海安譜實驗科技股份有限公司；SHB ⅢA型循環水式真空泵：杭州大衛科教儀器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯科技發展有限公司；Milli-Q型超純水儀：美國Millipore公司；ML1602型百分之一分析天平、AE200型萬分之一分析天平：美國梅特勒-托利多公司；LRH-250型生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；FSJ-Ⅱ型錘片式糧食粉粹機：中儲糧成都糧食貯藏科學研究院；YM-060S型超聲波清洗機：深圳市雨盟超聲波清洗機設備廠；DL-1型萬用電爐：北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 水解試驗

分別將10種高粱（S1～S10）粉粹，過120目篩，每種樣品稱取1.50 g，分別采用20 mL甲醇水溶液（95∶5，V/V）超聲提取1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液0.4 mL，用超純水稀釋3倍，經0.2 μm濾膜過濾后進三重四級桿液相色譜-質譜聯用儀，測量并計算10種高粱中蜀黍氰苷含量[26]。

參考GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》[27]中方法對高粱進行酸水解：稱取S1高粱粉10.00 g（以絕干計）于全玻璃蒸餾器的500 mL燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，塞嚴瓶口，攪拌2 h后加入20 mL 100 g/L的乙酸鋅溶液和2.00 g酒石酸后迅速連接好蒸餾裝置，將與冷凝管下端相連的乳膠軟管插入盛有10 mL 20 g/L氫氧化鈉溶液的200 mL容量瓶中，進行蒸餾，收集蒸餾液約190 mL時停止加熱，以蒸餾水定容至200 mL，混勻。按上述方法依次對S2～S10高粱進行水解，每種高粱各進行三次平行實驗，測定餾出液中氰化物含量，方法參照GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》中氣相色譜法，對高粱粉中蜀黍氰苷含量及其水解餾出液中氰化物含量進行直線回歸和雙變量相關分析。

1.3.2 模擬蒸酒試驗

分別以1.3.1中的蜀黍氰苷含量最低的S1高粱粉（739 μg/kg，以絕干計）和蜀黍氰苷含量最高的S2高粱粉（9 160 μg/kg，以絕干計）為原料，進行實驗室模擬蒸酒試驗。取固態白酒出窖糟醅10.5 kg，充分拌勻，分別設置空白組、實驗組和對照組進行試驗。

空白組：稱取1 000.00 g出窖糟醅，放置1 h；

實驗組：稱取1 000.00 g出窖糟醅，加入S1高粱粉150.00 g（以絕干計），混勻，潤糧1 h；

對照組：稱取1 000.00 g出窖糟醅，加入S2高粱粉150.00 g（以絕干計），混勻，潤糧1 h。

向空白組、實驗組和對照組酒糟中各加入糠殼30.00 g，拌勻，分別采用實驗室小型蒸酒裝置進行蒸餾，分段接餾分酒，每段接取100 mL，各接取4段，分別以D1、D2、D3和D4表示，空白組、實驗組和對照組各進行三次平行實驗，采用氣相色譜法[27]測定餾分酒中氰化物含量。

1.3.3 釀酒試驗

釀酒原料的組成為：高粱36%，大米22%，糯米18%，小麥16%，玉米8%（均為質量分數）。按以下步驟進行釀酒試驗：選擇宜賓地區某酒廠小試基地6口正常生產的小窖池（長、寬、高均為1.2 m），以其中3口作為實驗組，編號分別為1號窖、2號窖和3號窖，以另外3口作為對照組，編號分別為4號窖、5號窖和6號窖。配制原料以備用：（1）實驗組原料：采用S1高粱作為原料，按照配比加入另4種原料后粉碎；（2）對照組原料：采用S2高粱作為原料，加入和實驗組相同的另4種原料后粉碎。

第一輪釀酒試驗：將實驗組1號窖和對照組4號窖中的出窖糟醅全部起出置于一起，充分拌勻后平均分成兩部分，一半加入實驗組原料后拌勻潤糧，加糠殼拌勻，物料上甑，蒸酒蒸糧（實驗組第一輪酒取樣），物料出甑，打量水，攤晾下曲，入1號窖池發酵；另一半加入對照組的原料后拌勻潤糧，加糠殼拌勻，物料上甑，蒸酒蒸糧（對照組第一輪酒取樣），物料出甑，打量水，攤晾下曲，入4號窖池發酵。按照此方法依次完成2號窖、5號窖及3號窖和6號窖的全部實驗。

第二輪釀酒試驗：發酵60 d后，實驗組：將1號窖池中的糟醅起出，加入實驗組原料后拌勻潤糧，加糠殼拌勻，物料上甑，蒸酒蒸糧（實驗組第二輪酒取樣），物料出甑，打量水，攤晾下曲，入1號窖池發酵。對照組：將4號窖池中的糟醅起出，加入對照組的原料后拌勻潤糧，加糠殼拌勻，物料上甑，蒸酒蒸糧（對照組第二輪酒取樣），物料出甑，打量水，攤晾下曲，入4號窖池發酵。按照此方法依次完成2號窖、5號窖及3號窖和6號窖的全部實驗。

第三輪釀酒試驗：按第二輪釀酒試驗步驟完成第三輪釀酒試驗和取樣。

白酒蒸餾出來后，測定原酒酒精度和酒中氰化物含量，按GB 5009.223—2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》方法測定EC含量[28]，將所有酒樣置于28 ℃恒溫培養箱中貯存，分別于第10天、第20天時測定原酒中氰化物和EC含量，之后每隔30 d測定一次氰化物和EC含量，總監測時間為350 d。

1.3.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010進行作圖和數據分析，并使用SPSS 22.0軟件對數據進行顯著性分析，重復試驗3次，結果以“平均值±標準差”（）表示。

2 結果與分析

2.1 水解試驗結果

本試驗將10種高粱粉碎，過120目篩，高粱粉粒度較小，再采用蒸餾水攪拌浸提2 h，讓高粱中蜀黍氰苷溶解到蒸餾水中，加入乙酸鋅溶液和酒石酸，進行酸水解，讓蜀黍氰苷充分轉化為氫氰酸，氫氰酸沸點較低，蒸餾過程中極易被蒸出，以氫氧化鈉溶液吸收后測定餾出液中氰化物含量，結果見表1，對高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量進行直線回歸和雙變量相關分析，結果見圖1。

表1 高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量Table 1 Content of dhurrin in sorghum powder and cyanide in its hydrolytic distillate μg/kg

圖1 高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量的相關曲線Fig.1 Correlation curve of dhurrin content in sorghum powder and cyanide content in hydrolysis distillate

由表1可知，10種高粱粉中蜀黍氰苷含量與其水解餾出液中氰化物含量具有一定的差異性，其中，S1高粱中蜀黍氰苷含量最低，平均值為739 μg/kg，S2高粱中蜀黍氰苷含量最高，平均值為9 160 μg/kg。由圖1可知，高粱中蜀黍氰苷含量與其水解生成的氰化物呈現一定的線性關系（相關系數R2為0.892 6），說明高粱中蜀黍氰苷水解可生成氰化物，且高粱中蜀黍氰苷含量與其水解所生成的氰化物總量呈正相關。

2.2 模擬蒸酒試驗結果與分析

在實驗室采用小型蒸酒裝置進行蒸酒試驗，糟醅量較少，蒸餾速度快，測定各段餾分酒中氰化物含量并進行顯著性分析，結果見表2。

表2 各段餾出酒中氰化物含量Table 2 Cyanide content in distillates of each stage μg/kg

由表2可知，空白組、實驗組和對照組各段餾分酒中氰化物含量變化趨勢一致，前段餾分酒（D1）中氰化物含量最高，隨著蒸餾的進行，餾分酒中氰化物快速降低，末段餾分酒（D4）中氰化物含量最低。從表2還可看出，實驗組各段餾分酒中氰化物含量顯著低于對照組中相對應餾分酒中氰化物含量（P＜0.01）。餾分酒中的氰化物主要來自于兩個方面：①糟醅中由β-葡萄糖苷酶水解所生成的氰化物在蒸酒時進入到餾分酒中；②高粱粉中的蜀黍氰苷在高溫下發生酸水解，最終生成氰化物，蒸酒時進入到餾分酒中。本試驗的空白組、實驗組和對照組所使用的出窖糟醅相同，餾出酒中來自于糟醅的氰化物相同，排除了基底干擾，引起餾分酒中氰化物含量差別大的主要因素是原料，實驗組所使用的S1高粱蜀黍氰苷含量遠低于對照組所使用的S2高粱，其蜀黍氰苷水解所生成的氰化物含量也相應低于S2高粱。

2.3 釀酒試驗結果與分析

采用手持式密度計測定三輪釀酒試驗原酒的酒精度，結果發現，原酒酒精度差別較小，約為71%vol。監測第一輪、第二輪、第三輪酒樣中氰化物和EC含量，結果分別見圖2A、圖2B和圖2C。

圖2 三輪釀酒試驗原酒中氰化物和氨基甲酸乙酯含量的變化Fig.2 Changes of cyanide and EC contents in base Baijiu of three rounds of brewing tests

從圖2A～2C可看出，三輪釀酒試驗的實驗組和對照組原酒中氰化物降低趨勢一致，EC上升趨勢也相一致：原酒中初始氰化物含量較高，隨著貯存時間的延長，酒體中氰化物含量急劇降低，貯存前10 d，氰化物降低速度最快，其后降低速度有所減緩，貯存50～80 d時，酒中氰化物檢出值極低；實驗組和對照組剛蒸餾出來的原酒中EC含量均較低，約為20～40 μg/kg，隨著貯存時間的延長，酒體中EC含量緩慢上升，貯存350 d時，所有原酒樣品中EC含量達到了相對穩定狀態，原酒中絕大部分EC是在貯存過程中生成的，這與高曉娟等[17]的貯存階段是清香型白酒中EC急劇增加環節的研究發現相似。從圖2B和圖2C可看出，6號窖池的第二輪酒、3號窖池及4號窖池的第三輪酒中EC生成速度比其他酒樣快，酒體中EC達到平衡狀態所需時間比其他酒樣短，表明EC的生成還有其他影響因素。從圖2A～2C還可看出，三輪釀酒試驗的實驗組原酒中氰化物初始含量低于對照組原酒中氰化物初始含量，達到了相對穩定狀態時（貯存350 d），實驗組原酒中EC含量低于對照組原酒中EC含量。

對原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時EC值進行直線回歸和雙變量相關分析，結果見圖3。由圖3可知，原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時EC值線性關系良好，相關系數R2=0.966 9，二者在0.01水平上顯著相關，說明在原酒貯存過程中，氰化物是EC的重要前體物。

圖3 原酒中氰化物初始含量和貯存350 d時氨基甲酸乙酯含量的相關曲線Fig.3 Correlation curve of initial cyanide content in base Baijiu and ethyl contents at 350 d of storage

2.4 討論

在第一輪釀酒試驗中，實驗組1號窖和對照組的4號窖出窖糟相同，實驗組2號窖和對照組的5號窖出窖糟相同，實驗組3號窖和對照組的6號窖出窖糟相同，相對應窖池的第一輪酒中來自于出窖糟醅的氰化物也相同，引起酒體中氰化物含量不同的主要因素是釀酒原料，實驗組采用的高粱原料為蜀黍氰苷含量低的S1高粱，對照組采用的高粱原料為蜀黍氰苷含量高的S2高粱，S1高粱水解所生成的氰化物也低于S2高粱，因此，實驗組各窖池原酒中氰化物初始含量均低于對照組相應窖池原酒中氰化物初始值，貯存350 d時，實驗組各窖池原酒中EC含量低于對照組相應窖池原酒中EC含量。

在第二輪釀酒試驗中，實驗組與對照組原酒中氰化物初始含量和達到穩定狀態時EC含量差別更大。引起酒體中氰化物初始含量不同的主要因素有兩個：①酒體中來自于糟醅的氰化物不同。第二輪酒的出窖糟醅由兩部分組成，一部分是循環發酵的母糟，另一部分是上一輪糧食發酵形成的糟醅；②蒸酒過程中，酒體中來自于原料的氰化物不同。因實驗組持續采用S1高粱作為高粱原料，對照組則采用S2高粱作為高粱原料，在第三輪釀酒試驗中，實驗組與對照組原酒中氰化物含量差別繼續擴大，EC含量差別也進一步增大，實驗組原酒中來自于糟醅部分的氰化物幾乎全部由S1高粱及另四種原料發酵所形成的糟醅所貢獻，對照組原酒中來自于糟醅部分的氰化物則幾乎全部由S2高粱和另四種原料發酵所形成的糟醅所貢獻。

3 結論

高粱是白酒釀造的重要原料，本研究以不同高粱為對象，分別進行了水解試驗、模擬蒸酒試驗和釀酒試驗，探索了高粱中蜀黍氰苷與濃香型白酒中氰化物、EC之間的關系。試驗結果表明：高粱中蜀黍氰苷含量與其水解所生成的氰化物總量呈正相關，采用蜀黍氰苷含量低的高粱作為釀酒原料時，酒中氰化物含量較低，EC生成量也較少，濃香型白酒中絕大部分EC是在貯存過程中生成的，氰化物是EC的重要前體物。

濃香型白酒釀造工藝復雜，生產周期長，酒體中微量成分多，EC研究難度較大。本研究發現濃香型白酒中絕大部分EC是在貯存過程中生成的，因此，研究者在探索濃香型白酒中EC生成機理時，可重點關注貯存階段。感官風味是白酒香型判別和品質鑒定的重要基礎，中國白酒香型眾多，每一種香型的白酒都有其獨特的生產工藝，研究者在探索白酒中EC控制措施時，應以不改變原有生產工藝、不影響酒體風格為前提。

本研究首次從生產水平上證實了高粱中蜀黍氰苷是濃香型白酒中EC的一個關鍵控制點，濃香型白酒生產企業采用蜀黍氰苷含量低的高粱作為釀酒原料，可有效降低酒中氰化物和EC含量。本研究為濃香型白酒生產企業控制酒體中EC含量、提高產品安全水平提供了實踐依據，也為其他香型白酒EC控制提供了參考。