富硒藍莓全果果酒體外消化特性研究

趙 勇，雷湘蘭，蔡仁教，王 相，肖海燕，郭利芳

（海南職業技術學院 熱帶農業技術學院，海南 海口 570216）

果酒中的多酚、多糖、有機酸等抗氧化成分賦予果酒特定的抗氧化活性，因而適量飲用果酒可以提高機體的抗氧化能力從而降低氧化應激對機體造成的傷害，有報道指出飲用果酒對機體的保健作用主要是由于其中豐富的多酚類物質的抗氧化作用[1-4]，多酚類物質必須是生物可利用的狀態才能發揮生物活性，而生物可利用狀態受到多酚類物質的釋放、穩定性以及被機體的吸收利用情況因素的影響[5-6]，大部分酚類物質處于結合狀態，因而其生物活性較低。要全面評估任何一類植物化學物的生物利用度，必須考慮其藥代動力學特性，例如吸收、代謝、組織和器官的分布以及從體內排泄，然而在臨床或體內進行這樣的研究是復雜的，技術上困難并且昂貴，因而體外模擬消化是研究人員常用的方法。CELEP E等[7]對藍莓酒、黑桑葚酒、櫻桃酒在模擬胃腸液下的多酚物質及抗氧化活性進行研究，發現所有樣品中的酚類物質含量在模擬胃腸液消化后含量下降，同時對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、H2O2清除率以及總抗氧化活性都降低。YANG H等[8]研究得出，海紅果果酒中對DPPH、超氧陰離子和羥自由基有很強的清除活性，其中鄰二酚和雙酚是主要的抗氧化活性成分。?AKAR U等[9]研究發現，發酵前添加纖維素酶和糖對幾種果酒（藍莓、黑莓、覆盆子和酸櫻桃）的α-葡萄糖苷酶的抑制作用有不同的影響，其中藍莓和黑莓果酒具有最高的抑制活性，其中酚類物質中的綠原酸和咖啡酸被認為是重要的活性成分。YANG H等[10]報道海紅果果酒中的蘆丁、兒茶素、表兒茶素、柚皮苷、二氫查耳酮、β-甾醇可以顯著提高高脂血癥小鼠體內的脂代謝，增加高密度脂蛋白、降低血黏度、抑制小鼠肝臟中血小板的聚集和脂肪的蓄積。LIANG L H等[11]研究發現，桑葚中提取的花青素在模擬胃腸液下反應后生物可利用度、回收率都下降，但抗氧化活性提高。

藍莓果酒是以藍莓為原料經過一系列處理后發酵而成的富含有機酸、氨基酸、多糖、多酚、維生素等功能性成分的酒精性飲料。大量研究表明，藍莓果酒具有較高的抗氧化活性[12-15]，乳酸菌、酵母菌富硒后具有更好的生物活性及發酵特性，并且其發酵的產品風味、抗氧化等功能特性更好[16-20]，但有關富硒酵母發酵藍莓全果果酒的抗氧化活性及其體外消化特性鮮見報道。本研究采用添加亞硒酸鈉制作的富硒酵母發酵藍莓全果果酒，通過體外模擬胃腸液反應的方法對富硒藍莓全果果酒在胃腸液消化后的酚類物質含量和抗氧化性能進行分析，為評價富硒藍莓全果果酒經胃腸消化后的生物活性，進一步說明富硒藍莓果酒的體內抗氧化等功能特性提供理論基礎，為開發功能性更強的藍莓果酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

藍莓：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JK10：煙臺帝伯仕有限公司。

1.1.2 化學試劑

焦亞硫酸鈉（分析純）：安慶新亞菱化工有限公司；碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸、甲醇（均為分析純）：成都科龍化學試劑廠；福林酚、鄰苯三酚、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）自由基（均為分析純）：索萊寶（北京）有限公司；DPPH、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，pNPG）（均為分析純）：美國Sigma公司；胃蛋白酶（酶活3 000 U/L）、胰酶（250 U/L）、膽鹽（分析純）：生工生物工程（上海）股份公司；沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草醛、對香豆酸、蘆丁、槲皮素（純度均＞98%）、α-葡萄糖苷酶（酶活0.4 U/mL）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：蛋白胨20 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

CP114電子天平：奧豪斯儀器有限公司；HY-2恒溫水浴調速多用振蕩器：上海躍進儀器有限公司；Stratos低溫高速離心機、U3000高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國Thermo Fisher公司；FE28 酸度計：梅特勒托利多（中國）有限公司；UV-1100紫外/可見分光光度計：上海MAPADA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 富硒藍莓全果果酒加工工藝流程及操作要點

操作要點：

預處理：將藍莓清洗干凈、晾干，打漿機打漿，得到藍莓全果漿。

調配：加入白砂糖調整初始糖度為20°Bx，加入50 mg/L焦亞硫酸鈉，攪拌均勻。

酵母活化及富硒：在5%糖水中36 ℃活化30 min得到活化酵母菌，酵母按照4.5%接種于亞硒酸鈉質量濃度為50 μg/mL的YEPD培養基中25 ℃發酵90 h，即得富硒酵母。

接種：活化酵母或富硒酵母按照4.5%添加量加入上述調配后的藍莓全果漿中。

發酵：裝罐封口發酵（25 ℃，7 d），當酒精度和還原糖含量基本保持穩定時終止發酵。

過濾：發酵完成后用濾布濾去酒渣，得到濾液。

陳釀：濾液16 ℃下陳釀1～2個月，即得富硒藍莓全果果酒成品。

1.3.2 模擬胃腸液制備[7，11，21]

模擬胃液：稱取1.6 g胃蛋白酶，1.0 g氯化鈉，溶解在500 mL去離子水中，用0.1 mol/L鹽酸將pH調為2，0.45 μm濾膜過濾備用。

模擬腸液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，膽鹽12.5 g，胰酶2.0 g，溶解在500 mL去離子水中，用0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液調pH至6.8，0.45 μm濾膜過濾備用。

1.3.3 體外胃腸液模擬消化反應[7，11，21]

胃液環境模擬反應：取5 mL酒樣加入模擬胃液35 mL混合均勻后，37 ℃、100 r/min水浴搖床振蕩反應1.0 h、3.0 h后取樣進行多酚含量及抗氧化活性測定，反應完成后置于冰水中終止反應。

腸液環境模擬反應：在上述模擬胃液反應液中加入0.1 mol/L NaHCO3，調節pH為7.0，加入5 mL配制好的模擬腸液，37 ℃、100 r/min水浴搖床振蕩反應0.5 h、1.0 h后取樣進行多酚含量及抗氧化活性測定，反應完成后置于冰水中終止反應。

1.3.4 抗氧化性檢測

西達里亞油田屬于碎屑巖油藏。2005年以前，油田開發主力層位集中在上、中、下油組。2005年至2011年，技術人員發現新的油藏層系阿4段，但由于當時認識不到位，該層系僅用來采取零星補孔及合采措施。

羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力測定：按照文獻[8]中方法進行；DPPH清除能力測定：按照文獻[11]中方法進行；ABTS清除能力測定：按照文獻[22]中方法進行。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性[9]

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）配制α-葡萄糖苷酶（0.4 U/mL）、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）溶液（10 mmol/L）。200 μL樣品溶液與200 μLα-葡萄糖苷酶溶液混勻，37 ℃下反應15 min后加入200 μL pNPG溶液，37 ℃反應10 min，加入1 mL碳酸鈉溶液終止反應。在波長405 nm處測定吸光度值，α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式如下：

其中：As為樣品組的吸光度值；Ac為對照組，即磷酸緩沖液代替樣液且不加α-淀粉酶溶液的吸光度值；Ab為空白組，即磷酸緩沖溶液代替樣液且加入α-淀粉酶溶液的吸光度值。

1.3.6 總多酚的測定[23]

取1mL樣品加入0.1mol/L福林酚試劑5 mL，充分混勻的加入7%Na2CO3溶液15 mL。然后立即將溶液稀釋到25 mL，室溫靜置2 h，在波長750 nm處測定吸光度值，以沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y=0.138 0x+0.025 3，相關系數R2=0.997 3。按照回歸方程計算樣品中總多酚含量，最終結果以mg沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）/mL表示。

1.3.7 酚酸的測定[7]

酚酸采用HPLC法進行檢測，其色譜條件如下：使用XDB-C18分離柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱溫25 ℃，二極管陣列檢測器，流動相：A相為10 mmol/L磷酸溶液，B相為甲醇；洗脫程序：進樣量10 μL，流速1 mL/min，0～15.0 min（0～60%B），15～20 min（60%～80% B），20.0～22.0 min（80%～100%B），22～27 min（100%～0B），27～32 min（0B）。與標準品出峰時間對比進行定性，通過峰面積進行定量分析。

采用Sigmplot 10.0作圖，利用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 富硒藍莓全果果酒模擬胃腸液消化后總多酚含量

以非富硒酵母發酵藍莓全果酒為對照，富硒藍莓全果果酒在模擬胃腸液消化后總多酚含量測定結果見表1。由表1可知，兩種酒樣中的總多酚都隨著模擬胃腸液的消化下降，隨著消化時間的延長而下降，這與有關的研究報道結果相一致[7，21]。富硒藍莓全果果酒和對照果酒中的總多酚在模擬胃液消化1.0 h后分別較未消化時下降5.04%、8.59%，3.0 h后下降10.44%、12.31%，樣品下降的程度低于對照，由于樣品中經過富硒酵母發酵后多酚含量本身較高，同時富硒酵母發酵后酒體具有更強的耐受胃液等環境的能力，因而總多酚在模擬胃液消化中含量始終顯著高于對照（P＜0.05）。在經過腸液消化后兩種酒體中總多酚含量進一步下降，模擬腸液消化0.5 h和1.0 h后樣品和對照中的總多酚含量分別下降16.07%、23.57%、20.90%、29.58%，樣品中下降的幅度小于對照，可能與本身較高的多酚含量有關，也可能與酒體中的硒有關，同時富硒酵母本身對氧化應激、極低pH、酶等環境的適應能力增強，由其發酵的酒體對胃腸液的酸性環境及酶的消化具有一定的耐受能力。與相關報道的結果類似[7]。

表1 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后總多酚含量測定結果Table 1 Determination results of total phenolic contents in two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion mg GAE/mL

2.2 富硒藍莓全果果酒模擬胃腸液消化后抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一種以氮為中心的有機自由基，在波長517 nm處有強吸收，當樣品中有抗氧化劑時，自由基的孤對電子會被配對，吸收則會減弱，溶液顏色變淺，吸光度值也會減小，吸光度值的大小可反映樣品的抗氧化活性強弱。以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品經過不同胃腸液消化后對DPPH自由基的清除率結果見圖1。

圖1 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后對DPPH自由基清除率Fig.1 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on DPPH radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion

由圖1可知，兩種酒體在經過胃腸液消化后對DPPH自由基的清除率都下降，樣品下降的程度低于對照，且同一消化條件下樣品對DPPH自由基的清除率顯著高于對照（P＜0.05），這與富硒酵母的發酵有關，富硒后酵母生成β-葡萄糖苷酶能催化烷基糖苷和芳基-β-D-葡萄糖苷的糖苷鍵的水解轉化，從而釋放葡萄酒中的酚醛苷元[24-25]。樣品在模擬胃腸液消化下較高的抗氧化活性也可能與富硒酵母發酵后酒體中酚酸釋放氫離子后對自由基清除活性有關，也可能富硒后酵母代謝生成了硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸等含硒化合物，這些物質在模擬胃腸液消化過程對多酚類物質具有一定的保護作用。

2.2.2 ABTS自由基清除活性

ABTS自由基可與具有供氫能力的抗氧化劑反應，生成無色的ABTS，通過吸光度值的變化分析樣品抗氧化能力強弱。以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品經過不同胃腸液消化后對ABTS自由基的清除率結果見圖2。由圖2可知，樣品和對照酒樣在模擬胃腸液消化后對ABTS自由基的清除率均下降，經過胃液消化3.0 h樣品和對照分別由最初的61.43%、45.34%下降為46.89%、32.17%，進一步經過腸液消化1.0 h后對ABTS自由基的清除率為33.56%和18.12%，說明部分抗氧化活性的物質包括多酚、黃酮、花青素、多糖、有機酸等在胃腸液消化后部分降解或失去活性。樣品在模擬胃腸液下對ABTS自由基的清除率高于對照（P＜0.05），報道加入硒后酚酸在其芳香苯環和自由電子對之間發生共振，從而誘導電子離域，有效的電子離域增加了對ABTS自由基的清除[26-27]，因而樣品在胃腸液消化后具有更高的自由基清除活性。

圖2 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后對ABTS自由基的清除率Fig.2 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on ABTS radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion

2.2.3 超氧陰離子自由基清除活性

超氧陰離子自由基是一種活性氧自由基，能使機體新陳代謝失常，引發生物體衰老，還可誘發多種疾病，如腫瘤、心血管疾病和癌癥等，因而評價兩種藍莓全果果酒在模擬胃腸液消化下對超氧陰離子自由基的清除率具有重要的意義。以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品經過不同胃腸液消化后對超氧陰離子自由基清除率結果見圖3。由圖3可知，樣品和對照未消化時對超氧陰離子自由基的清除率分別為86.43%和78.58%，樣品對超氧陰離子自由基的清除率顯著高于對照（P＜0.05）。而在模擬胃腸液消化后對超氧陰離子自由基的清除能力都下降，模擬胃液消化3.0 h后下降為72.11%、65.36%，且樣品的超氧陰離子自由基清除率高于對照（P＜0.05）。模擬腸液消化后清除率接近，模擬腸液消化0.5 h 后為60.44%和58.34%，1.0 h后為52.67%、49.45%。

圖3 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后對超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on superoxide anion free radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion

2.2.4 羥自由基清除活性

羥自由基具有強氧化性，是一種對機體有害且毒性最強的活性氧自由基，測定羥基自由基能夠綜合反映物質的抗氧化活性。以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品經過不同胃腸液消化后對羥自由基的清除率結果見圖4。

圖4 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后對羥自由基的清除率Fig.4 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on hydroxyl radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion

由圖4可知，樣品和對照在模擬胃腸液消化下對羥基自由基有一定的清除能力，但清除率都較未消化時有一定程度的下降，樣品在消化1.0 h、3.0 h后分別下降為63.45%、55.77%，而對照則下降為61.34%、55.32%，在胃液消化3.0 h后對羥自由基的清除率接近。經過腸液進一步消化1.0 h后樣品和對照分別為41.89%、42.76%。結果表明，樣品和對照經過胃腸液消化后對羥自由基的清除率沒有明顯差異（P＞0.05）。

2.2.5α-葡萄糖苷酶抑制活性

體外消化后對α-葡萄糖苷酶的抑制活性可以間接反映對機體血糖的控制，以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品在模擬胃腸液消化后對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用結果見圖5。由圖5可知，兩種藍莓果酒均對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，在模擬胃腸液消化后仍能保持較高的抑制活性。模擬胃液消化1.0 h后樣品和對照對α-葡萄糖苷酶的抑制活性由45.34%、37.34%增加為46.43%、38.65%，而經過3.0 h的胃液消化后則下降為41.54%、35.67%，樣品的抑制活性顯著高于對照（P＜0.05）。經過腸液消化1.0 h后樣品和對照分別下降為33.55%、28.57%，差異不顯著（P＞0.05）。?AKAR U等[9]報道的藍莓果酒具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且其中的綠原酸和咖啡酸是主要的活性物質，說明果酒中的酚酸類物質是抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物質，而樣品中的抑制活性高于對照與樣品未消化前以及消化后較高的酚酸含量有關，這一結果與表2的結果相呼應。

圖5 兩種藍莓全果果酒模擬胃腸液消化前后對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.5 α-glucosidase inhibitory activities of two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion

2.3 富硒藍莓全果果酒模擬胃腸液消化后酚酸變化

以非富硒酵母發酵藍莓全果果酒為對照，富硒藍莓全果果酒樣品中多酚經過模擬胃腸液消化后酚酸的組成及含量進一步進行檢測，結果見表2。由表2可知，樣品消化前共有沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草醛、對香豆酸、蘆丁、槲皮素7種酚酸，其中含量最高的為沒食子酸（1.53 μg/mL），其次為蘆丁（0.52 μg/mL），香草醛和槲皮素的含量較低，分別為0.05 μg/mL和0.09 μg/mL。各種酚酸經過胃液消化后含量都下降，胃液消化1.0 h后沒食子酸含量為1.39 μg/mL，而蘆丁為0.47 μg/mL，香草醛含量沒變，其他幾種酸略有降低，這與模擬胃液消化后抗氧化活性降低的結果相呼應。而經過模擬胃液3.0 h消化后，各種酚酸含量降低明顯，沒食子酸降低26.14%，而蘆丁下降40.38%，其他幾種酚酸都有不同程度的降低，香草醛下降為0.03 μg/mL。經過腸液的進一步消化后酚酸的含量進一步降低，香草醛在腸液消化后未檢測到，咖啡酸、對香豆酸和槲皮素在腸液消化1.0 h后未檢測到，沒食子酸含量為0.98μg/mL，綠原酸為0.11μg/mL，蘆丁為0.17 μg/mL，這一結果與相關報道的土耳其藍莓果酒、蘋果中提取多酚在模擬胃腸液消化后酚酸的含量降低的結果一致[7，22]，也與酒體模擬胃腸液后抗氧化活性、α-葡糖糖苷酶抑制活性降低的結果相呼應。

表2 樣品在模擬胃腸液消化后各種酚酸的測定結果Table 2 Determination results of phenolic acids of two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion μg/mL

3 結論

富硒酵母發酵藍莓全果果酒和非富硒酵母發酵藍莓全果果酒在模擬胃腸液消化后總多酚含量、抗氧化活性以及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性都較消化前下降，相同消化條件下富硒酵母發酵藍莓全果果酒總多酚含量、抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性更高。3.0 h胃液消化1.0 h腸液消化后富硒藍莓全果果酒中總多酚含量是對照的1.28倍，對DPPH、ABTS、O2-自由基的清除活性是對照的1.27、1.85、1.07倍，對羥自由基的清除活性與對照無顯著差異（P＞0.05），對α-葡萄糖苷酶抑制活性是對照的1.18倍。富硒酵母發酵藍莓全果果酒經胃腸液消化后主要的酚酸為沒食子酸（0.98 μg/mL）、綠原酸（0.11 μg/mL）、蘆?。?.17 μg/mL）。富硒酵母發酵藍莓全果果酒經胃腸液消化后具有較高的生物活性，適合開發功能性發酵果酒。