具有降血壓功能乳酸菌的篩選及其益生作用

王雅麗，李雪龍，余 萍，閔祥博，矯艷平*，李東紅

（1.江西仁仁健康產業有限公司，江西 樟樹 331200；2.遠大生命科學（遼寧）有限公司，遼寧 沈陽 110171）

高血壓是指以體循環動脈血壓（收縮壓和/或舒張壓）增高為主要特征，伴或不伴心、腦、腎等器官功能或器質性損傷的心血管綜合征[1-2]。目前臨床中針對高血壓患者多采用常規降血壓藥物進行治療，但此類藥物通常需長期應用才可見明顯效果，且患者經長期用藥后會面臨較多的毒副作用與不良反應，因而探索相對安全、無副作用的治療方式顯得尤為重要。近年來，諸多研究表明，高血壓和腸道菌群的失調具有直接關系，而且口服益生菌制品可通過改善腸道菌群進而明顯降低血壓[3]。此外，高血壓的控制與多種代謝途徑有關，而血管緊張素轉換酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）的調節是一個關鍵調控因素[4-5]。ACE是從人體組織和體液中發現的一種二肽羧肽酶，通過將血管緊張素I轉化成血管緊張素Ⅱ來提高血壓[6]，在人體心血管系統中起著至關重要的作用。

益生菌是一類對機體健康產生有益作用的活性微生物，可以調節腸道微生態的平衡以及腸道微生物的代謝活動[7-8]。研究表明，益生菌在發酵過程中通過其胞外蛋白酶、肽酶（羧肽酶、氨肽酶）的水解作用，將食物蛋白（如乳蛋白）中具有降壓活性的肽片段釋放出來，它們能與ACE活性中心結合，競爭性地抑制ACE活性，使血管緊張素Ⅰ不能轉化為血管緊張素Ⅱ，并催化緩激肽水解成為失活片段，從而起到降血壓的作用[9-10]。因此，具有降血壓功能的益生菌篩選與研究成為人們日益關注的焦點。

本試驗以體外ACE抑制率為考察指標，采用ACEKit-WST試劑盒[11-12]篩選ACE活性抑制能力較強的菌株，從而獲得降血壓功能菌株，并考察菌株的耐受性，以期為菌株的進一步應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）HCS01-013：中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.19510；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（菌株編號HOD02-001、HEL07-034、HEX12-005）；羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）（菌株編號ARD-12、AOD-17、ADF-23）；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）（菌株編號AMA-01、AME-03）；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）（菌株編號BDL-01、BHL-15、BFL-21）：本公司菌種庫保存。

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、胃蛋白酶（酶活≥3 000 U/g）：北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白酶（酶活≥5 000 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：生工生物工程（上海）股份有限公司；脫脂乳：飛鶴乳業有限公司；ACEKit-WST試劑盒：日本同仁化學研究所。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

改良MRS培養基[13]：酵母蛋白胨12 g，牛肉粉4 g，酵母粉3 g，磷酸二氫鉀2 g，乙酸鈉3 g，葡萄糖25 g，七水合硫酸鎂0.58 g，四水合硫酸錳0.25 g，吐溫800.6 g，番茄汁10 mL，蒸餾水1 000 mL，調pH至6.2，115 ℃滅菌30 min；固體培養基瓊脂添加量2%。

1.2 儀器與設備

DHP-500BS恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器有限公司；TGL-16M低溫高速離心機：長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；PHS-25酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Multiskan FC酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DZKW-S-4恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；JA2003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；101-1ES電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫療儀器廠；MDF-382E（CN）醫用低溫箱：松下冷鏈（大連）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

將保藏于-80 ℃冰箱的試驗菌株取出，室溫條件下解凍、混勻，取1環菌液于改良MRS固體培養基劃線，37 ℃培養48 h；選取菌落形態、大小一致的單菌落接種至5 mL改良MRS液體培養基中，37 ℃培養17 h；將菌液全部接種至100 mL改良MRS液體培養基中繼續37 ℃培養17 h，得到活化3代后的菌液，待用[14]。

將上述得到的3代菌液以3%的接種量，接種至質量分數為11%的脫脂乳中[15]，37 ℃培養20 h，測定pH，并調節至6.0±0.02。取適量培養物，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，再次將pH調整至6.0±0.02；取上清液1 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液為待測樣品[16]。

1.3.2 ACE抑制率檢測

本試驗為篩選具有ACE抑制率高的菌株，采用ACEKit-WST試劑盒對12株供試菌株ACE的抑制率進行檢測，按照表1添加量分別在酶標板中加入待測樣品、去離子水、底物緩沖液和酶工作液，37 ℃反應1 h后，按照試劑盒說明書配制指示劑工作液，加入指示劑工作液，室溫條件下（20～25 ℃）反應10 min（見表1），立即在波長450 nm處測定吸光度值[17]。

表1 各孔添加溶液的體積及反應條件Table 1 Volume and reaction conditions of solution addition in each well

1.3.3 模擬胃、腸液試驗

取上述1.3.1制得的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、10 min、5 ℃）獲得菌泥，用PBS沖洗3次，獲得的菌泥重懸于10 mL模擬胃液中，37 ℃條件下消化3 h，分別于0 h、3 h取樣，按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的方法進行菌落計數；將傳代三次的菌液振蕩搖勻，取菌懸液10 mL離心（5 000×g、10 min、5 ℃）獲得菌泥，用PBS沖洗3次，獲得的菌泥重懸于10 mL的人工腸液中，37 ℃條件下培養，于0、2 h、4 h分別取樣測活菌數[18-19]，計算菌株存活率。

1.3.4 耐酸試驗

將傳代3次的菌液按照10%的接種量分別接種于空白對照、pH2.0和pH3.0的基礎MRS培養基中。37 ℃靜置培養，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進行一系列的10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1 000 μL進行活菌計數，每個稀釋度3次重復，37 ℃靜置培養36～48 h后計數。

1.3.5 耐膽鹽試驗

將活化3次的菌液按照10%的接種量分別接種于空白對照及不同膽鹽質量分數0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進行系列10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1 000 μL進行活菌計數，每個稀釋度3次重復，37 ℃靜置培養36～48 h后計數。

1.3.6 計算公式

ACE酶抑制率計算公式如下：

式中：A450（樣品）為加入待測樣品及酶液的反應液在波長450 nm處的吸光度值；A450（blank1）為加入去離子水及酶液的反應液在波長450 nm處的吸光度值；A450（blank2）為加入去離子水的反應液在波長450 nm處的吸光度值。

胃腸液內菌株存活率計算公式如下：

式中：N1表示人工胃腸液中培養不同時間后取樣計數測得的活菌數，CFU/mL；N0表示空白對照組，即0 h時測得的活菌數，CFU/mL。存活率為取對數值后的比例。

耐酸試驗菌株存活率計算公式如下：

式中：N2表示不同pH條件培養后取樣計數測得的活菌數，CFU/mL；N0表示空白對照試驗測得的活菌數，CFU/mL。存活率為取對數值后的比例。

耐膽鹽試驗菌株存活率計算公式如下：

式中：N3表示不同膽鹽濃度條件培養后取樣計數測得的活菌數，CFU/mL；N0表示空白對照試驗測得的活菌數，CFU/mL。存活率為取對數值后的比例。

1.3.7 數據處理

試驗均進行3次重復實驗，結果以“平均值±標準差”形式表示。差異顯著性采用SPSS 19.0分析處理，P＜0.05表示顯著影響，P＜0.01 表示極顯著影響。

2 結果與分析

2.1 不同菌株發酵液ACE抑制率比較

由圖1可知，12株試驗菌株中有4株菌的ACE抑制率都在40%以上，表現出較好的ACE抑制作用，分別是鼠李糖乳桿菌HOD02-001、鼠李糖乳桿菌HCS01-013、鼠李糖乳桿菌HEX12-005、嗜酸乳桿菌AMA-01；其中鼠李糖乳桿菌HCS01-013的ACE抑制率為61.54%，明顯高于其他菌株，因此進一步對其耐受性進行研究。3株羅伊氏乳桿菌對ACE的抑制水平較為接近且普遍偏低，平均抑制率為21.16%，而瑞士乳桿菌的平均抑制率為36.09%。王睿等[20]研究利用堿性蛋白酶酶解雙孢菇蛋白產生的ACE抑制率最大，此時ACE抑制率可達43.75%；朱啟鵬等[21]應用粉碎、超聲獲得生姜、枸杞、梔子的混合醇提物，以麥芽糊精、變性淀粉、兩者混合分別與明膠作為復合包埋壁材，利用噴霧干燥制成微膠囊微膠囊經胃腸消化后其中ACE抑制率為49.64%。

圖1 不同菌株發酵液ACE抑制率比較Fig.1 Comparison of ACE inhibition rates in fermentation broth of different strains

2.2 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬胃、腸液試驗結果

2.2.1 模擬胃液試驗結果

由表2可知，與對照菌株相比，鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬胃液中的存活能力較強，經3 h處理，活菌對數值變化趨勢較小，仍可達到9.14以上，且存活率達99.9%。說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013在胃內有較高的存活率，為發揮益生作用提供基礎。

表2 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬胃液試驗結果Table 2 Results of simulated gastric juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.2.2 模擬腸液試驗結果

由表3可知，鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬腸液中的活菌對數值略趨于一致，4 h后仍可達到9.1以上，此時存活率為99.7%，表明鼠李糖乳桿菌HCS01-013菌株在模擬腸液中的存活能力較強，能夠以較高的活性進入腸液環境并存活。

表3 鼠李糖乳桿菌HCS01-013模擬腸液試驗結果Table 3 Results of simulated intestinal juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.3 菌株HCS01-013的耐酸環境能力測定結果

由表4可知，在pH 3.0的條件下，菌株HCS01-013的存活率為88.85%。在pH 2.0的條件下，活菌數雖有所下降，但存活率仍達71.95%，說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013的耐酸性較好。

表4 鼠李糖乳桿菌HCS01-013在不同pH溶液中的活菌數及存活率Table 4 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in different pH solution

2.4 菌株HCS01-013的耐膽鹽能力測定結果

由表5可知，在0.3%的膽鹽質量分數環境下，菌株HCS01-013的存活率為99.67%，當膽鹽質量分數提升到1.5%時，活菌數略下降，鼠李糖乳桿菌HCS01-013存活率為96.79%，說明其耐膽鹽能力較強。

表5 鼠李糖乳桿菌HCS01-013不同濃度膽鹽溶液中的活菌數及存活率Table 5 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in bile salt solution of different concentration

3 討論

試驗表明，鼠李糖乳桿菌HCS01-013能夠有效抑制ACE的活性，具有較強的降血壓功能，同時在模擬人體胃腸道環境下有較強的耐受能力，在耐酸和耐膽鹽試驗中菌株存活率較高，能夠通過耐受胃腸道環境到達腸道發揮降血壓作用。ACE是使血壓升高的關鍵性酶，而益生菌的降血壓主要在于能夠通過代謝產生蛋白酶，進而降解蛋白質產生的肽段對ACE產生抑制作用[22-23]。還有研究表明，某些益生菌能夠產生γ-氨基丁酸，通過調節中樞神經系統，作用于脊髓的血管運動中樞，能有效的促進血管擴張，從而起到降血壓的作用[24]。此外，吳正均等[25]研究發現，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LC2W的細胞自溶物對原發性高血壓大鼠具有顯著的降壓作用，而這種降壓作用主要來自于細胞自溶物的多糖一肽聚糖復合物。試驗僅從益生菌發酵乳對ACE活性的抑制這一方向入手，研究鼠李糖乳桿菌HCS01-013的降血壓功能，后續研究可以從γ-氨基丁酸和菌體自溶物兩個方向進行摸索試驗，進一步探究鼠李糖乳桿菌HCS01-013的降血壓機制。

4 結論

本試驗通過測定12種菌株發酵液的ACE抑制率，得到鼠李糖乳桿菌HCS01-013的ACE抑制率最高為61.54%。其在模擬胃液環境中存活率達99.9%；在模擬腸液環境4 h后存活率為99.7%；在pH2.0的條件下存活率仍達71.95%；膽鹽質量分數在1.5%時，存活率為96.79%，說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013能夠在胃液和腸道中發揮活性作用，且降血壓能力較強，具有較高的降血壓應用價值以及開發前景。