野葛總黃酮的提取工藝優化及抗氧化活性研究

龔 頻，翟鵬濤，張夢璇，陳雪峰，2*，王小娟，陳福欣

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安 710021；3.西安科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710054）

葛根（Pueraria lobata）屬于花豆科，形狀類似于蝶形，是葛屬植物的根，葛根屬共有26種，其中具有藥用價值的通稱為葛根，目前主要分布于亞洲、北美和南美[1]。它源于中國，其根在食品和制藥工業中有著悠久的應用歷史。我國葛根種類繁多，且產量豐富，其中野葛的產量較多，使用范圍較廣。它盛產于廣東、廣西等地[2]，主要以栽培為主。葛根中富含淀粉、異黃酮類、黃酮類物質[3]。葛根中葛根素和總黃酮的含量不到根莖的1/10[4]。葛根的生物學和藥理作用主要歸功于葛根素及其衍生物[5]。根中含有豐富的葛根素，通常被用作營養補充品葛根的唯一來源，而不包括其他地上部分（如葉和莖）[6]。與地上部分相比[7]，葛根不僅富含次生代謝產物，還富含植物碳水化合物，包括淀粉、纖維素和水溶性碳水化合物。葛根最早在西漢的《三國志·神農本草經》中就有記述說明，葛根味甘且酸，且性涼，不僅可以有效地緩解人體內的熱毒還可以促進人體內津液的分泌[8-9]?！侗静菥V目》中記述“大約稱取葛粉四兩，用浸泡了一夜米的水去溶解，煮制，并用米湯服用”有一定的緩解煩躁和止渴的作用。藥理學研究表明，葛根中大豆苷元、葛根素、蘆丁等多種有效成分與抗氧化、心臟保護、神經保護、抗癌和抗炎活性等藥理作用相關[10]。其中的異黃酮類化合物對降血壓、血脂和血糖及心腦血管疾病有顯著的療效，還可以分解酒精和保護肝臟，抗糖尿病[11]，對骨質疏松還有一定的預防作用[12-13]。

葛根中黃酮類物質的提取方法較多，傳統方式主要有熬煮、浸提、水提、乙醇回流提取等，目前提取的新技術則有滲濾、超聲波提取、微波提取、超臨界提取等[14-17]。韓劍等[18]用正交試驗法，優化了葛根的提取條件；趙浩如等[19]通過對幾種提取方式的對比分析，最終確定滲濾法是適合葛根的提取方法；彭游等[20]對葛根中的黃酮類化合物用微波輔助法進行提取，研究發現提取效果良好；張喜梅等[21]用超聲波輔助提取法對葛根中的總黃酮類物質進行提取，提取率為1.81%；邢秀芳等[22]對葛根先用纖維素酶進行降解，再用乙醇和正丁醇提取從而得到總黃酮，提取率為1.84%；王星敏等[23]采用酶發酵技術，對葛根廢渣中的植物組織進行分解，然后從這些分解的植物組織中提取黃酮類化合物，提取率為0.37%。本實驗用乙醇回流法提取野葛中的黃酮類化合物，通過單因素試驗和正交試驗優化野葛總黃酮提取工藝，并采用紫外分光光度法分析野葛總黃酮對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、總還原能力和·OH清除能力，考察其抗氧化活性。以期為合理利用葛根資源以及開發黃酮類制品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野葛：同仁堂；無水乙醇、甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；葛根素對照品、蘆丁對照品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：上海笛醫生物科技有限公司；無水硫酸鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、過硫酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-2000B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；98-Ⅱ-B電子控溫磁力攪拌電熱套：金壇市金祥龍電子有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵：金壇市金祥龍電子有限公司；KQ3200型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HC-150T2高速多功能粉碎機：永康市綠可食品機械有限責任公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器；HGZF-101-2烘箱：上海躍進醫療器械有限公司；UV-5100紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 野葛總黃酮的提取

將野葛洗凈之后，切成薄片后晾干并進行粉碎得到野葛粉末。在不同的水浴條件下進行乙醇回流提取，過濾提取液，提取兩次，合并濾液，定容、備用。

1.3.2 野葛總黃酮提取工藝優化

（1）單因素試驗設計

稱取每份5 g的藥材共5份?；A單因素條件為：料液比1∶10（g∶mL），體積分數為70%的乙醇溶液，80 ℃，60 min，乙醇回流提取2次。分別在乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%、80%；料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）；提取時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下，考察乙醇體積分數、料液比、提取時間及提取溫度對總黃酮提取率的影響。

（2）正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，提取時間60 min，以總黃酮提取率為評價指標，選擇乙醇的體積分數（A）、料液比（B）和提取溫度（C）為影響因素，進行3因素3水平L9（33）正交試驗設計，對野葛總黃酮的提取工藝進行優選。正交試驗因素與水平見表1。

表1 提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization

（3）總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法。

蘆丁標準曲線的繪制：稱取蘆丁標準品5 mg，用2.5 mL的甲醇溶液超聲溶解，并加超純水定容在25 mL的標準容量瓶中，搖勻得到0.2 mg/mL的母液。依次吸取上述母液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL的標準容量瓶中，首先加入6 mL的水溶液，然后加入1 mL 5%亞硝酸鈉水溶液搖勻后靜置5 min，再加1 mL 10%的硝酸鋁水溶液，搖勻后靜置5 min，最后再加10 mL 4%的氫氧化鈉水溶液，并加水稀釋至一定刻度，搖勻靜置15 min即可，過0.45 μm濾膜。再利用紫外分光光度法在波長500 nm處測定吸光度值。以蘆丁標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。得到標準曲線回歸方程y=0.014 2x-0.012 0，相關系數為R2=0.994 4。

1.3.3 供試溶液的制備

精密稱定濃縮得到的提取物0.1 g，用2.5 mL甲醇溶解在25 mL標準容量瓶中，加水定容至刻度，振蕩搖勻后吸取2 mL轉移至25 mL的標準容量瓶中，然后根據“制備標準曲線”的方法配制成0.32 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm濾膜，在波長500 nm處測定吸光度值，按照標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.3.4 野葛總黃酮提取率的計算

野葛提取液經過紫外檢測后所得到的吸光度值，再通過標準曲線回歸方程計算即可得出總黃酮的質量濃度；總黃酮的提取率的計算公式如下：

式中：C為待測物的質量濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；k為稀釋倍數；m為藥材質量，g；V2為測定用體積，mL。

1.3.5 野葛總黃酮體外抗氧化試驗

（1）DPPH·清除能力的測定

配制質量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的樣品溶液和質量濃度為0.05 mg/mL DPPH·溶液。以VC作陽性對照。

對照品：2 mL DPPH·溶液+2 mL無水乙醇，記為A對；樣品：2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品溶液，記為A樣；空白：2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇，記為A空。

常溫下放置30 min后，在波長510 nm處測定吸光度值。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：A空為空白吸光度值；A樣為樣品吸光度值；A對為對照品吸光度值。

（2）總還原能力的測定

取1 mL不同質量濃度的樣液，先加2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀水溶液混勻，在50 ℃保溫20 min，隨即添加2.5 mL 10%的三氯乙酸水溶液、5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵水溶液，攪拌均勻后，靜置10 min為宜，再以無水乙醇代替樣液按上述處理作為空白，在波長700 nm處測吸光度值（OD700nm值），以VC作陽性對照[24-26]。

當溶液中加入具有還原性物質，會發生一系列的反應。鐵氰化鉀會還原成亞鐵氰化鉀，在酸性條件下，亞鐵氰化鉀會與三氯化鐵進行結合，生成普魯士藍。普魯士藍在700 nm波長條件下有最強吸收，因此可以通過在對應的波長下測定吸光度來檢驗還原性物質的總還原能力。吸光度值越大，表示樣品的還原能力越強。

（3）·OH清除能力的測定

分別取不同濃度的樣品溶液2 mL，然后加2 mL 9 mmol/L的FeSO4水溶液和8.8 mmol/L的H2O2水溶液，振蕩均勻后靜置10 min，加9 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻后靜放30 min。檢測在波長510 nm處的吸光度值，記為A；不加野葛黃酮的水溶液，其他操作方法同上，所測吸光度值記為A空；用蒸餾水替代水楊酸，所測吸光度值記為A對；以相同質量濃度的VC溶液作為陽性對照。·OH清除率計算公式如下：

式中：A空為空白吸光度值；A為樣品吸光度值；A對為對照吸光度值。

2 結果與分析

2.1 提取工藝優化單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇體積分數在40%～80%范圍內的增大，提取率呈現先增后減的趨勢。在乙醇體積分數為40%～50%時，提取率隨之增加；在乙醇體積分數為50%時，提取率達到最高；在乙醇體積分數＞50%之后，隨著乙醇體積分數的增大，提取率逐漸下降。因此，最佳乙醇體積分數為50%。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2 料液比的影響

從圖2可以看出，隨著溶劑用量的增大，總黃酮提取率呈先增后減的趨勢。當料液比為1∶5～1∶20（g∶mL）時，提取率隨之升高；當料液比為1∶20（g∶mL）時，提取率達到最高；當料液比為1∶20～1∶25（g∶mL），提取率隨之降低。因此，最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3 提取溫度的影響

從圖3可以看出，隨著提取溫度在50～90 ℃范圍內的升高，提取率呈現先增后減的趨勢。當提取溫度為50～70 ℃時，提取率隨之增高；當提取溫度為70 ℃時，提取率達到最高；當提取溫度高于70 ℃之后，提取率反而越來越低。因此，最佳提取溫度為70 ℃。

圖3 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4 提取時間的影響

從圖4可以看出，隨著提取時間在30～150 min范圍內增加，提取率呈現先增后減的趨勢。在提取時間為30～120 min時，提取率隨之增高；在提取時間為120 min時，提取率達到最高；在提取時間＞120min之后，提取率有所降低低。因此，最佳提取時間為120 min。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2 提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，固定提取時間為60 min，以總黃酮提取率為評價指標，選擇乙醇的體積分數（A）、料液比（B）和提取溫度（C）為影響因素，進行3因素3水平L9（33）正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表2。

表2 提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction process optimization

續表

由表2可知，對結果影響的因素由大到小依次為溫度（C）＞乙醇體積分數（A）＞料液比（B），最佳提取工藝組合為A1B2C3，即料液比1∶20（g∶mL），乙醇體積分數40%，80 ℃水浴條件下提取2 h，提取2次，總黃酮的提取率達到3.01%。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，提取率分別為3.18%、3.00%、2.99%，平均提取率為3.06%。

2.3 野葛總黃酮體外抗氧化試驗結果

2.3.1 野葛總黃酮對DPPH·清除能力的測定

由圖5可知，當VC質量濃度在0.2～0.8 mg/mL時，隨著VC質量濃度的增加，清除DPPH·的能力增加很快。野葛總黃酮對DPPH·的清除能力隨著野葛總黃酮質量濃度的增加逐漸增強，并且DPPH·清除率與總黃酮質量濃度呈正相關。但野葛總黃酮對DPPH·的清除能力和VC相比較而言明顯偏低。野葛總黃酮對DPPH·的最大清除率為72.98%。

圖5 野葛總黃酮對DPPH·的清除能力的影響Fig.5 Effect of total flavonoids from Pueraria lobata on DPPH·scavenging ability

2.3.2 野葛總黃酮對·OH清除能力的測定

由圖6可知，當野葛總黃酮質量濃度在0.2～0.4 mg/mL時，清除·OH的能力逐漸增加，當其質量濃度為0.4 mg/mL，清除能力最強；在0.4 mg/mL以后，野葛清除·OH的能力基本趨于平衡。野葛清除·OH的能力和VC相比較而言明顯偏低。野葛總黃酮對·OH的最大清除率為65.38%。

圖6 野葛總黃酮對·OH的清除能力的影響Fig.6 Effect of total flavonoids from Pueraria lobata on OH·scavenging ability

2.3.3 野葛總黃酮總還原能力的測定

物質的抗氧化能力和還原能力呈正比。由圖7可知，質量濃度在0.2～0.8 mg/mL的時候，野葛和VC的還原能力隨著其相對應濃度的增加而逐漸變大，但野葛的還原活性遠遠低于VC。野葛總黃酮的最大還原能力為0.16。

圖7 野葛總黃酮總還原能力Fig.7 Total reducing ability of total flavones from Pueraria lobata

3 結論

本試驗采用乙醇回流法從野葛中提取總黃酮，經過單因素試驗和正交試驗確定其最佳的提取工藝為體積分數為40%乙醇，料液比1∶20（g∶mL），80 ℃水浴提取2 h，共2次，合并濾液。在此優化條件下，總黃酮的提取率是3.06%?？寡趸囼灲Y果表明，野葛總黃酮質量濃度分別為0.8 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL時，對DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力、總還原能力最大值分別為72.98%、65.38%、0.16。在試驗設計的一定濃度范圍內，抗氧化能力隨著野葛總黃酮質量濃度的增大而增強，由此說明野葛總黃酮是一種具有抗氧化能力的物質，可用于抗衰老功能食品的開發和應用。