基于質譜技術篩查兒童Graves病新環境干擾物的研究

夏 秦 陳臨琪 宋浩潔 陳秀麗 謝蓉蓉 王鳳云 吳海瑛 孫 輝 張丹丹 陳 婷

Graves 病(Graves' disease,GD)是由遺傳和環境因素的相互作用導致免疫耐受喪失,自身免疫系統攻擊甲狀腺所引起的疾病。 GD 是兒童甲狀腺功能亢進癥最常見的原因,在兒童時期相對發生率不高,為(0.9 ～14.1)/10 萬,在青春期達到高峰,女性多于男性[1～4]。 目前已報道的與GD 相關的環境因素主要包括碘、硒、輻射、吸煙、感染、維生素D、壓力、雌激素、免疫調節劑和甲狀腺化學干擾物等[5]。 這些環境因素主要通過直接影響甲狀腺功能或引起自身免疫反應,間接破壞甲狀腺組織來誘發疾病的發生[6]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UHPLC-QTOF/MS)分析初診未治GD 兒童血清中低分子環境干擾物水平,并與正常兒童比較,以期發現影響GD 發病風險的新環境干擾物。

對象與方法

1.研究對象：選取2017年3月～2018年10月首次就診于蘇州大學附屬兒童醫院的初診GD 患兒30例作為實驗組(GD 組),同時收集同期在筆者醫院行健康體檢,其年齡、性別與GD 組相匹配的健康兒童30 例作為對照組。 所有研究對象均長期生活在蘇州市內。 GD 診斷參考《中國甲狀腺疾病診治指南——甲狀腺功能亢進癥》和《European Thyroid Association Guideline for the Management of Graves' Hyperthyroidism》[9,10]。 所有受試者均進行一般性體格檢查和實驗室評估,排除肝功能異常、心血管并發癥或其他內分泌及免疫性疾病。 另外受試者均為青春期前兒童。通過Tanner 分期來評估青春期發育,只有睪丸體積＜4ml的男孩和乳房發育為Tanner Ⅰ期的女孩被納入研究[1]。 本研究通過蘇州大學附屬兒童醫院醫學倫理學委員會審批(倫理審批號：2020CS020),在研究對象簽署知情同意書的基礎上,進行血樣本的采集。

2.一般資料及臨床指標：本研究收集就診時患兒年齡、性別、體重、甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體指標。甲狀腺功能及抗體均利用電化學發光免疫分析法在蘇州大學附屬兒童醫院實驗室進行檢測。 于早晨8：00時抽取空腹靜脈血2ml,置于-80℃保存,待集中檢測。

3.質譜法檢測低分子物質：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UHPLC-QTOF/MS)測定血清中的低分子代謝物水平。

4.儀器與試劑：超高效液相(1290UHPLC)購自美國Agilent 公司,;高分辨質譜(Triple TOF 6600)購自美國AB Sciex 公司;離心機(Heraeus Fresco17)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;天平(BSA124S-CW)購自德國Sartorius 公司;純水儀(明澈D24 UV)購自德國Merck Millipore 公司;超聲儀(PS-60AL)購自深圳市雷德邦電子有限公司;色譜柱(ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1 × 100mm)購自美國Waters 公司。 實驗用甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水(來自CNW Technologies),L-2-氯苯丙氨酸購自上海恒柏生物科技有限公司,實驗用水為純水。

5.實驗過程[11]：取100μl 樣本,加入400μl 含有內標的提取液(甲醇∶乙腈體積比為1∶1,內標濃度為2μg/ml),渦旋混勻30s;超聲5min(冰水浴);-20℃靜置1h;將樣本4℃,12000r/min 離心15min;取出425μl 上清于EP 管中;在真空濃縮器中干燥提取物;向干燥后的代謝物加入100μl 提取液(乙腈∶水體積比為1∶1)復溶;渦旋30s,冰水浴超聲10min;將樣本4℃,12000r/min 離心15min;取出60μl 上清于2ml LC/MS 進樣瓶,每個樣本各取10μl 混合成QC 樣本,再取60μl 進行UHPLC-QTOF-MS 分析。

6.利用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定血清中的總碘,實驗方法參考既往研究[12]。

7.統計學方法：兩組間篩選的低分子代謝物數據利用多元變量統計分析和單變量統計分析進行聯合分析,本項目使用的卡值標準為P＜0.05,同時OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP) ＞1.2,且該物質在該組對比兩組實驗間的倍數關系(fold change,FC) ＞1.20 或＜0.83。 兩組間總碘水平的對比利用SPSS 25.0 統計學軟件包進行統計分析。 符合正態分布的計量資料采用t檢驗方法,以均數±標準差(±s)表示;不符合正態分布的計量資料均采用秩和檢驗,以中位數(四分位數間距)[M(Q1,Q3)]表示。 之后采用Logistic回歸分析找出與GD 發病最相關的物質。差異低分子環境干擾物與GD 組臨床指標之間的關系利用Spearman相關性分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.一般資料：對GD 組和對照組一般資料進行對比分析,兩組間性別、年齡未見明顯差異,GD 組體重明顯低于對照組[24.86(20.38,28.25)kg vs 26.48(22.73,29.16)kg,P＜0.001]。 另外,GD 組FT3(17.57 ± 9.24pmol/L vs 6.02 ± 0.49pmol/L,P＜0.001)水平明顯高于對照組,FT4(55.86 ±31.09pmol/L vs 17.67 ± 2.06pmol/L,P＜0.001)水平明顯高于對照組,TSH (0.0067 ± 0.0039mIU/L vs 2.6100 ±1.3100mIU/L,P＜0.001)水平明顯低于對照組。

2.總碘水平的差異：用非參數檢驗對不符合正態分布的碘離子進行統計學分析得出碘離子濃度在GD組為115.90 (78.70,143.28) μg/L,在對照組為70.02(55.18,83.25)μg/L,GD 組明顯高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.01)。

3.基于非靶向代謝組學篩選GD 組與對照組間差異環境干擾物：基于非靶向代謝組學技術篩選出21 種差異低分子環境干擾物。 與正常對照組比較,有15 種低分子干擾物在GD 組升高,6 種在GD 組降低(圖1)。

圖1 兩組間顯著性差異低分子環境干擾物

4.GD 環境干擾物的Logistic回歸分析：用單變量二元邏輯回歸來分析差異低分子環境干擾物及總碘與GD 之間的相關性(表1),在排除來源不明、標準差過大或Exp(β)值接近于1 的物質后,對符合條件的6 種物質(包括黃酮、D-來蘇糖、密葉辛木素、3-烯丙基-4-羥基苯乙酮、3-己酮和葡萄甾酮A)進行多因素二元Logistic逐步前進回歸分析(表2)。 結果提示密葉辛木素是GD 的獨立保護因素,P=0.002,Exp(β) =0.001;松甾酮A 是GD 的獨立危險因素,P=0.007,Exp(β) =14.136。

表1 環境低分子干擾物的單因素二元Logistic 回歸分析

表2 GD 顯著相關環境干擾物的多因素二元Logistic 逐步回歸分析

5.GD 組中差異環境干擾物與甲狀腺臨床指標的相關性分析：用Spearman對以上兩組間差異有統計學意義的環境干擾物與臨床指標之間進行統相關性分析(P＜0.05,圖2)。 根據相關系數＞0.4 進行篩選,結果表明,黃酮、1-萘酚、對甲酚、密葉辛木素和5,6,7,8-四羥基-2-萘甲酸與TPOAb呈負相關,呋喃妥因和反式-3-香豆酸與TPOAb 呈正相關。茴香烯與TRAb 呈正相關。 7-甲基黃嘌呤與TSH 和TGAb 呈負相關,泛昔洛韋與FT4呈正相關,5, 6,7,8-四羥基-2-萘甲酸與TT3、FT4、TT4呈正相關,D-來蘇糖與TT3呈負相關,與FT4呈負相關,3-烯丙基-4-羥基苯乙酮與FT3、TT3呈負相關。

圖2 GD 組差異性低分子環境干擾物與甲狀腺功能及自身抗體之間的相關性分析

討 論

GD 的發病風險和病情進展受到多種環境因素影響,有研究者認為,輻射、碘攝入和環境毒物與GD易感性最相關[5,14]。 基于UHPLC-QTOF/MS 的非靶向技術可對有機體內代謝物進行全面、系統的分析,實時揭示機體生理病理狀態,并能夠從廣泛大量的數據中提取有用的差異數據[15]。 該技術既往在多種自身免疫性疾病,如類風濕關節炎或多發性硬化中均有應用[16,17]。 但鮮有研究將該技術應用于與兒童GD 篩查環境內分泌干擾物。

本研究結果表明,松甾酮A 在GD 組明顯升高,并作為GD 的獨立危險因素。 松甾酮A 屬于蛻皮激素的一種,來源于羅漢松等植物及蟹等甲殼類動物[18,19]。 既往雖然尚無松甾酮A 與甲狀腺疾病之間相關性的報道,但其他的水產(如劍魚)被證明是產后甲狀腺炎的危險因素[20,21]。 本研究對象均生活在蘇州市,蘇州市作為水鄉,盛產魚、蝦、蟹,當地居民飲食中此類食物消耗較大。 因此,松甾酮A 可能是蘇州市當地GD 的一個特異性危險因素,但該結論尚需更大樣本量的研究證實。 本研究還發現,密葉辛木素可作為GD 獨立保護因素,并與TPOAb 呈明顯負相關。 密葉辛木素屬于倍半萜類天然產物,植物苔類是其豐富來源[22]。 既往研究發現,密葉辛木素作為中藥的成分具有抗三陰性乳腺癌作用和密葉辛木素抗菌活性[23,24]。 目前尚缺乏密葉辛木素與甲狀腺之間關系的研究。 其具體機制尚需開展進一步動物研究進行驗證。

黃酮類化合物包括木犀草素和芹菜素等物質,廣泛存在于水果、蔬菜和堅果等食物中,與日常生活息息相關[25]。 黃酮具有多種生物活性,如抗病毒、抗炎、抗過敏、抗氧化等,并在動脈粥樣硬化、糖尿病及癌癥等疾病中起保護作用[26]。 研究表明,黃酮可以調節甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)的合成和分泌。 Sartelet 等[27]研究發現,黃酮與甲基硫氧嘧啶結構相似,能夠抑制TPO 活性。 Panda 等[28]研究發現,在四氧嘧啶誘發的糖尿病小鼠模型中,芹菜素可以有升高TH 水平的作用,而在正常小鼠中則使TH 水平降低。 另外類異黃酮也被證明與甲狀腺功能相關,一項研究發現,女性異黃酮的攝入量與TSH 升高存在相關性[29]。 此外,異黃酮作為一種植物雌激素,大量補充還可以使亞臨床甲狀腺功能減退癥發展成為甲狀腺功能減退癥的概率增加[30]。 本研究發現,GD 組黃酮濃度明顯較對照組降低,與既往研究結果一致,由此推測黃酮可能通過抑制TH 合成對兒童GD 起到保護作用。 此外,本研究還發現,GD 組黃酮與TPOAb 水平呈負相關,后者作為一種氧化應激的誘導因子,可反映GD 患者的OS 水平[31]。 推測TPOAb 與黃酮水平的負相關可能與黃酮的抗氧化活性有關。黃酮在GD 患者中的抗氧化作用及潛在的有益作用有待于進一步研究予以證實。

呋喃妥因是一種廣譜抗生素,既往是預防尿路感染復發的一線用藥,也常被置于飲用水或飼料中喂養牲畜魚類[32]。 雖然中國已經禁止畜牧業和漁業中呋喃妥因的濫用,但呋喃妥因在水產品中超標的事件仍屢有報道。 呋喃妥因可誘發患者出現多種自身免疫性疾病,包括自身免疫性肝臟和肺疾病,ANCA 相關性血管炎以及亞臨床紅斑狼瘡等[33～35]。 呋喃妥因作用于體液免疫和細胞免疫,使自身抗體生成增加,也可以刺激Th 細胞生成,并影響其與抑制性T 細胞之間的平衡[36,37]。 目前甲狀腺疾病與呋喃妥因之間的關系尚不明確。 本研究結果表明,呋喃妥因在GD 組中水平升高,并與TPOAb 水平呈正相關。 呋喃妥因對GD 病情的影響還有待于進一步研究明確。

綜上所述,GD 是一種受遺傳和環境因素共同影響的復雜疾病。 除既往已報道的環境因素外,仍有很多與GD 發病風險或疾病進程相關的環境干擾物尚待發現。 在本研究中,筆者通過質譜方法篩查出幾個可能參與兒童GD 發病機制的新因素,深入研究其具體的分子機制有助于為GD 的預防或治療提供新的思路。