基于lncRNA BANCR介導MMPs的表達探討夏枯草對甲狀腺乳頭狀癌增殖、侵襲和遷移的影響

婁永慶 陳紅躍

甲狀腺癌(thyroid cancer, TC)是內分泌系統中最常見的惡性腫瘤之一,約占每年全世界確診癌癥的3.4%,其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)最為常見,占85% ～90%[1,2]。 本課題組前期研究發現,夏枯草能夠有效抑制PTC 細胞的惡性行為,呈現濃度依賴性,然而其具體的分子機制目前尚不清楚[3]。 既往多篇研究報道,long non-coding RNA BANCR 在肺癌和膀胱癌中發揮著抑癌的功能,在黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌中卻作為致癌角色存在,而其在PTC 中的表現也相當復雜[4～13]。 目前,夏枯草與BANCR 之間的研究報道較少,因此,本研究通過體外培養B-CPAP 細胞實驗,探究夏枯草通過BANCR 對B-CPAP 細胞增殖、侵襲和遷移的影響及其具體的作用機制,為夏枯草應用于PTC 的防治提供一定的理論根據。

材料與方法

1.實驗細胞株：人甲狀腺乳頭狀癌細胞株(B-CPAP)購自中國上海iCell Bioscience 公司;正常人甲狀腺細胞株(Nthy-ori 3-1)購自北納(北京)生物技術研究院。

2.實驗藥物：夏枯草配方顆粒購自四川新綠藥業有限公司,批號：1809025,規格為5 克/盒,每克顆粒相當于生藥夏枯草8g。 順鉑,貨號：HY-17394,購自中國上海百舜生物科技有限公司,規格是100 毫克/瓶,純度大于99%。

3.實驗主要試劑與設備：胎牛血清、RPMI-1640、PBS、0.25%胰蛋白酶購自以色列Biological Industries 公司;青鏈霉素雙抗混合液、高效RIPA 裂解液、DMSO、PMSF 蛋白酶抑制劑、ECL 超敏化學發光檢測試劑盒、NC 膜購自中國北京索萊寶公司;CCK-8 試劑盒購自中國上海同仁化學科技公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自中國上海碧云天生物技術公司;蛋白電泳凝膠制備試劑盒購自中國西安晶彩生物技術有限公司);MMP2、MMP9、GAPDH 抗體、兔抗購自中國-武漢三鷹科技科技有限公司;lncRNA BNACR抑制劑、negative control、lncRNA BNACR RT 引物、lncRNA BNACRqPCR 引物、GAPDH 引物購自中國上海生工生物工程股份有限公司;RNA 快速提取試劑盒購自北京金百特生物科技有限公司;mRNA 反轉錄試劑盒、mRNA 擴增試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;Transwell 細胞共培養小室購自美國Corning 公司;超凈工作臺(JB-CJ-2FC 型)購自中國蘇州馮氏實驗動物設備有限公司;柜式恒溫培養箱(HZ150L 型)購自中國武漢瑞華儀器設備有限責任公司;超速低溫離心機(SIGMA3-K 型)購自美國Sigma-Aldrich 公司;全波長掃描式多功能讀數儀(Varioskan Flash 型)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;日立超速離心機(HITACHⅠ型)購自中國上海妙生科貿有限公司;蛋白凝膠成像系統(XBCX-S-044 型)購自中國上海艾研生物科技有限公司等。

4.siRNA 的引物合成和qRT-PCR 干擾BANCR：lncRNA BANCR 的有效干擾序列上游引物：5'-CCACAUAUCAGCUUGGUUUTT-3',下游引物：5'-AAACCAAGCUGAUAUGUGGTT-3';控制序列si-NC 序列上游引物： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。 通過實時熒光定量PCR 進行BANCR 的上游引物：5'-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3',下游引物：5'-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3';內部參考GAPDH 上游引物：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGG-3,下游引物：5'-TCGCCCCACTTGATTTTGA-3'。 以上序列由中國上海生工生物工程股份有限公司合成。

5.細胞培養與人甲狀腺癌細胞株的轉染：使用10%FBS 培養基培養B-CPAP 與Nthy-ori 3-1 細胞,培養瓶置于5%CO2、37℃的恒溫培養箱內。 當細胞濃度生長到70% 左右時,按照轉染和說明書的指導,將lncRNA BANCR siRNA 和si-NC 分別作用于細胞。 實驗分為正常甲狀腺細胞(N)組、甲狀腺乳頭狀癌細胞(B0)組、中藥夏枯草干預(B1.0)組、陰性對照(Bnc)組、siRNA 干預(Bsi)組、中藥夏枯草+siRNA 干預(B1.0 + si)組和順鉑干預的陽性對照(Bs)組。

6.夏枯草溶液的制備：取1g 夏枯草顆粒充分溶解于20ml RPMI-1640 完全培養液中,震蕩混勻,置于超聲儀器上處理30min,超速離心機2000r/min,離心10min,初步去除沉渣雜質,0.22mm 超微過濾器正壓抽濾除菌,制得濃度為40mg/ml 的夏枯草原液,4℃分裝保存備用。

7.qRTPCR 技術方法檢測lncRNA BANCR 表達水平的變化：轉染劑作用48h、夏枯草24h 以后,提取各組細胞所含總RNA,RNA 的純度及濃度測定后,反轉錄合成cDNA,儲存在-80℃冰箱備用。 GAPDH作為內參,qRT-PCR 檢測lncRNA BANCR 的表達含量[20μl 反應體系：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl,分別加入0.4μl(10μmol/L)上下游引物,2μl 的cDNA,體積不足20μl 用ddH2O補充]反應條件為：95℃預變性10min,然后95℃15s、60℃1min,共40 個循環。 結果以2-△△CT方法來統計,表示lncRNA BANCR 的表達量。

8.Western blot 法檢測MMPs 表達水平的變化：轉染劑作用48h、夏枯草24h 以后,提取各組細胞所含總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度,用于后續配置樣品,然后用SDS-PAGE 電泳將蛋白轉移至NC 膜上,并使用5%脫脂乳密封蛋白質。 然后,將兔抗MMP2、兔抗MMP9(1∶2000 稀釋)孵育蛋白條帶,并將條帶置于4℃冰箱過夜。 洗膜,孵育二抗(兔抗∶5%脫脂乳=1∶2000 稀釋),室溫搖床上放置1.5h,再次洗膜3 遍,30min 后,ECL 顯色,成像儀曝光拍攝。 采用Image J 軟件檢測各組條帶的灰度值,表示MMP2/9的相對表達含量高低。

9.通過CCK-8 法檢測甲狀腺癌細胞株的增殖：以10000 個/孔的濃度將B-CPAP 細胞接種在96 孔板中,配置每孔體積在100μl,每組需設立5 個副孔。放置37℃恒溫箱24h 后,細胞貼壁,甩去板內原液體,PBS 沖洗兩遍,并使用siRNA 轉染細胞。 48h 后,中藥組使用1.0mg/ml 濃度夏枯草溶液,每孔100μl的體積注入。 72h 后,甩去板內的夏枯草溶液,PBS沖洗兩遍,然后用移液器每孔打入8μl CCK-8 溶液,剩余用純培養基補充至100μl,置于培養箱中孵育1 ～6h,打開自動酶標讀數儀,波長調整為450nm,記錄吸光度(A)值,整理數據。

10.Transwell 實驗檢測B-CPAP 細胞侵襲能力的變化：將干擾序列和對照組的序列轉染到B-CPAP 細胞中,當轉染的細胞生長到80% ～90%且狀態良好時,用胰蛋白酶將貼壁細胞消化下來,加入2%無鏈紅霉素培養基配置成細胞懸液,顯微鏡下計數、統計,調整細胞濃度為3 ×105個/毫升,將細胞懸液100μl 加入到Transwell 小板的上室內,依照原先設計的分組緩慢向下層小室加入夏枯草、順鉑溶液各500μl,每組設立3 個復孔,37℃條件下反應24h。 小室底層的細胞用4%組織細胞固定液固定30min,結晶紫染色10 ～20min。 隨機選取5 個視野,拍照計數。

11.劃痕實驗檢測B-CPAP 細胞遷移能力的變化：轉染劑作用細胞48h 后,在培養板各孔劃出6 道“1”字樣劃痕,PBS 清洗兩遍,加入夏枯草(1.0mg/ml)、順鉑(10μg/ml)各2ml,置于ZOOM 顯微鏡下拍照,每6h 拍攝1 次,48h 后取出。 采用Image J 軟件對劃痕面積進行分析。

12.統計學方法：應用SPSS 21.0 統計學軟件對實驗數據進行統計分析,使用GraphPad Prism8.3 作圖,組間差異用單因素方差分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.夏枯草對B-CPAP 細胞中lncRNA BANCR 表達的影響：qRT-PCR 實驗結果顯示,與正常甲狀腺細胞比較,B-CPAP 細胞中lncRNA BANCR 高表達,而夏枯草作用于B-CPAP 細胞24h 后,lncRNA BANCR 的表達水平出現了顯著降低,各實驗組與B0組結果比較,差異有統計學意義(P＜0.05,圖1)。

圖1 各組細胞lncRNA BANCR 表達水平

2.夏枯草對B-CPAP 細胞中MMP2、MMP9 表達的影響：Western blot 法檢測結果顯示,B-CPAP 細胞中MMP2、MMP9 高表達,正常甲狀腺細胞中低表達(圖2)。 夏枯草作用于B-CPAP 細胞24h 及沉默了lncRNA BANCR 后能夠明顯下調MMP2、MMP9 的表達量,各實驗組與B0 組結果比較,差異有統計學意義(P＜0.05,圖3)。

圖2 夏枯草作用后各組蛋白印跡結果

圖3 夏枯草作用后各組相關蛋白表達水平

3.夏枯草對B-CPAP 細胞生存率的影響：B0組、Bnc 組細胞生長狀態良好,而在加入了1.0mg/ml 的夏枯草后,B1.0 組細胞存活率顯著降低,隨后敲低了B-CPAP 中lncRNA BANCR 的表達,其對B-CPAP細胞增殖的抑制效果更為明顯。 各實驗組與B0 組結果比較,差異有統計學意義(P＜0.05,圖4,圖5)。

圖4 夏枯草對B-CPAP 細胞形態的影響(×200)

圖5 夏枯草對B-CPAP 細胞存活率的影響

4.夏枯草對B-CPAP 細胞遷移力的影響：夏枯草作用于B-CPAP 和沉默BANCR 后的細胞株在12、24h,ZOOM 顯微鏡拍攝到的各組愈合過程的情況(圖6)。 實驗結果顯示,相同時間段內,各實驗組較甲狀腺乳頭狀癌細胞(B0)組,劃痕愈合率均出現不同程度降低,24h 與12h 比較,差異性更加明顯(P＜0.05)。

圖6 夏枯草對B-CPAP 細胞遷移力的影響(×200)

5.夏枯草對B-CPAP 細胞侵襲力的影響：Transwell 實驗結果顯示,加入1.0mg/ml 的夏枯草和轉染抑制劑的B-CPAP 細胞透膜量降低了約1/2,兩者同時作用效果更加明顯,各實驗組與甲狀腺乳頭狀癌細胞(B0)組結果比較,差異有統計學意義(P＜0.05,圖7)。

圖7 光鏡下各組細胞透膜數(×200)

討 論

近年來,隨著甲狀腺彩超、細針穿刺活檢(FNA)及基因檢測技術的迅速發展,早期甲狀腺癌的診斷準確率大大提升,過去10 多年間,我國甲狀腺癌術后5年生存率從67.5%提高至84.3%,但仍遠低于西方歐美國家(98.7%)[14]。然而,隨著甲狀腺癌發生率的不斷增長,因術后復發、轉移及并發癥所導致的死亡人數也在快速增加[15]。 因此,我們更加迫切希望尋求一味能夠有效抑制突變型PTC 細胞增殖、侵襲和轉移的藥物。 夏枯草作為一味軟堅、消腫、散結常用的中藥,其在甲狀腺疾病的防治方面已有超過千年的歷史[16]。 臨床治療結果證實,夏枯草在治療甲狀腺慢性、亞急性炎癥、甲狀腺腫及甲狀腺結節方面效果顯著[17,18]。 結合相關臨床數據和文獻資料來看,夏枯草在甲狀腺疾病防治方面具有極高的研究價值。

本實驗過程中還發現夏枯草作用于沉默了BANCR 的B-CPAP 細胞后,MMP2、MMP9 表達水平下降及其對B-CPAP 細胞增殖、遷移和侵襲作用的抑制效果更加明顯,因此證實夏枯草除了通過BANCR 調節MMP2、MMP9 的表達抑制PTC 細胞的惡性行為外,還可以通過別的途徑發揮其抑癌的作用。

綜上所述,夏枯草能夠有效抑制PTC 細胞的增殖、侵襲和遷移的過程,作用機制可能與通過下調lncRNA BANCR 來減少MMP2、MMP9 的表達相關,本研究為將夏枯草作為新型抗癌中草藥在臨床中推廣奠定了理論基礎。