番茄頸腐根腐病研究進展

蘇曉梅 朱春宇，2 劉淑梅 王施慧 呂宏君 侯麗霞*

〔1 山東省農業科學院蔬菜研究所，山東省設施蔬菜生物學重點實驗室，國家蔬菜改良中心山東分中心，農業農村部黃淮地區蔬菜科學觀測實驗站（山東），山東濟南 250100；2 中國農業大學園藝學院，北京100193〕

番茄頸腐根腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）是由尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐病專化型（f.sp.-，Forl）侵染引起的土傳性真菌病害，在設施生產中多有發生并逐年嚴重。近年來，隨著番茄設施栽培面積增大及種植年限增加，頸腐根腐病已成為影響番茄收益的重要病害之一。然而我國有關番茄頸腐根腐病的研究報道較少，且多數集中在病原菌鑒定以及防治措施的簡單描述方面，在頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選方面的工作相對落后，抗病育種工作進展也較為緩慢。本文綜述了該病害的國內外最新研究進展，以期為我國番茄頸腐根腐病的抗病育種提供借鑒。

1 番茄頸腐根腐病的發生情況

番茄頸腐根腐病俗稱“死棵病”，是近年來溫室內發生比較嚴重的一種真菌性病害。該病害最初于1974 年首次在日本被發現（Sato &Araki，1974），之后蔓延到世界各地，已對美國、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韓國以及歐洲和非洲等許多國家和地區的番茄生產造成重大損失（Sonoda，1976；Krikun et al.，1982；Brammall，1990；Mcgovern et al.，1998；Kim et al.，2001；Can et al.，2004；Portapuglia et al.，2005；Hibar et al.，2007；Jacobs &Heerden，2012；Sepúlveda-Chavera et al.，2014）。我國于2007 年首次在北京地區發現該病害（耿麗華 等，2012），隨后山東、黑龍江等地設施番茄主產區發生該病害，并呈現暴發趨勢。目前在山東、遼寧、寧夏、北京、黑龍江、河北、山西、甘肅等很多地區均有番茄頸腐根腐病發生的報道，嚴重威脅我國設施番茄生產（程琳 等，2016；張尚卿 等，2017；李瀟 等，2019）。最近幾年，我國東北、華北地區發病比較嚴重，尤以山東省壽光地區病情最為突出。據報道，壽光日光溫室番茄發病率達80%以上，致死率30%以上，造成番茄嚴重減產（程琳 等，2016）。

2 番茄頸腐根腐病的發病癥狀及規律

番茄頸腐根腐病常發生于保護地冬春季番茄生產中，在幼苗期和成株期均可發生，幼苗期（3～5片葉）染病時主要癥狀表現為在土壤與植株莖基部接觸部位出現明顯的深褐色病斑，幼苗從病斑處折倒而萎蔫致死；5 葉期以后至開花結果期發病則出現莖基部縊縮且呈深褐色，植株直立而萎蔫的癥狀（Menzies et al.，1990；耿麗華 等，2012），萎蔫最早出現在一天溫度最高時，夜間恢復。把染病的植株縱向剖面后，可以在根和根莖的皮層看到大量的褐變斑點和腐爛現象。由于對該病害了解較少，其經常被誤認為番茄枯萎病。研究表明，番茄頸腐根腐病與枯萎病在3 個方面有明顯差異：①發病癥狀不同。頸腐根腐病病原菌主要造成番茄莖基部和根部褐變腐爛，莖部維管束褐變通常在土壤線上方25～30 cm 以內，而枯萎病病原菌（f.sp.）為害維管束造成植株萎蔫，莖部維管束的褐變超過土壤線1 m；② 適宜的土壤溫度不同。番茄頸腐根腐病最適發病土壤溫度為18 ℃左右，而枯萎病為27 ℃左右；③寄主范圍不同。番茄枯萎病病原菌只能侵染番茄，而頸腐根腐病病原菌除了能夠侵染番茄外，還能侵染豆科、葫蘆科、藜科的一些植物（耿麗華 等，2012）。

番茄頸腐根腐病病原菌能夠通過土壤、根、葉片直接接觸傳播，通常病原菌通過傷口或新生根產生的自然孔洞侵染植株。該病害侵染周期較長，如果定植后感染，病癥一般在開始收獲前才得以表現；如果在育苗期間感染，病癥一般在開花時表現（劉蕾和王輝，2016）。此外，土壤pH 低、氨態氮以及土壤積水都能導致頸腐根腐病病情加重（Roberts et al.，2001）。該病原菌產生的小分生孢子以及厚垣孢子在病原菌的生長和傳播中起到了重要作用。壞死的組織中能夠產生大量的小分生孢子，它們能夠通過空氣流通傳播，易使殺過菌的土壤發生二次感染（Rekah et al.，1999）；厚垣孢子有更厚的細胞壁，使其能夠在土壤或者木質中存活更長的時間。該病原菌在無植物根系的土壤中傳播能力很弱，但能夠通過染病的植株以及土壤、農事操作人員和農業機械等生產設備攜帶的厚垣孢子進行長距離的傳播（Rekah et al.，2000）。

3 番茄頸腐根腐病的病原菌鑒定

對病原菌進行分離與鑒定是確定病害類型和進行病害治理的前提。植物病原菌傳統的鑒定方法通常從植株發病癥狀、病原菌形態特征、分子生物學鑒定和致病性測定等方面展開。

3.1 病原菌形態特征

耿麗華等（2012）、李景富等（2018）對影響番茄頸腐根腐病病原菌生長的環境條件進行了研究，發現該病原菌產孢最適培養基為PDA 培養基，碳源為葡萄糖，最適生長溫度為25 ℃，致死溫度為63 ℃，最適pH 值為8。該病原菌在PDA 培養基上呈淡紫灰色、白色或粉色，菌落圓形，平鋪生長，菌絲絨毛狀。25 ℃條件下在PDA 培養基上黑暗培養5 d，菌落直徑60 mm 左右（耿麗華 等，2012）。病原菌主要產生3 種類型的孢子：大分生孢子、小分生孢子和厚垣孢子。大分生孢子鐮刀形，長度20～25 μm，以3 個隔膜為主；小分生孢子長橢圓形或紡錘形，長度4～8 μm，通常無隔，是主要傳播形態；厚垣孢子為透明狀球形，頂生或間生，多為單獨生長，偶爾也對生或串生；分生孢子梗短、生于菌絲側面，單生，無分枝（耿麗華 等，2012；李景富 等，2018）。

3.2 病原菌分子生物學鑒定

近幾年隨著分子生物學發展，PCR 檢測技術在病原菌檢測領域得到了廣泛應用。利用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對番茄頸腐根腐病病原菌的rDNA-ITS 區進行PCR 擴增，可得到大小約500 bp 的片段，該引物在尖孢鐮刀菌的鑒定中得到廣泛應用。但是尖孢鐮刀菌不同專化型在rDNA-ITS 區段序列上差異性較小，因而該通用引物無法區分尖孢鐮刀菌種內不同專化型及生理小種。Hirano 和Arie（2006）根據尖孢鐮刀菌中多聚半乳糖醛酸酶基因設計特異性引物sprl來區分番茄頸腐根腐病病原菌Forl、番茄枯萎病病原菌Fol，以及Fol 的3 個生理小種，利用該引物通過PCR 可在Forl 小種中擴增出947 bp 大小的條帶，而其他小種均不能擴增產生條帶。

3.3 病原菌致病性測定

分子生物學鑒定難以區分致病與非致病菌株，Carmona 等（2020）在采集組織標本分離尖孢鐮刀菌致病菌株時，發現非致病尖孢鐮刀菌菌株同時存在，且存在的比例較高。因此，進行病原菌致病性測定是植物病原菌鑒定中必不可少的環節。將從田間病株分離獲得的病原菌于健康植株上進行回接，發病后取寄主病健交界處組織進行再分離，根據回接后寄主發病癥狀和再分離獲得的病原菌形態特征來確定病原菌種類。番茄頸腐根腐病病原菌（Forl）的寄主范圍很廣，區別于只侵染番茄的枯萎病病原菌（Fol），它不僅能夠侵染番茄，還能侵染辣椒、茄子、黃瓜、菜豆等其他作物，這為Forl 與Fol的區分提供了有力證據（Rowe，1980；Menzies et al.，1990；耿麗華 等，2012）。

4 番茄頸腐根腐病的抗性鑒定

室內苗期人工接種鑒定是種質資源抗病性鑒定的重要方法之一，其優點在于可以有效控制環境因子，且保證寄主只被單一病原菌侵染，同時能夠避免因病原菌蔓延而造成的生產影響，因此得到育種工作者的普遍重視。浸根法是目前進行番茄頸腐根腐病接種最常用的方法（Mutlu et al.，2015；Kim et al.，2016；Devran et al.，2018），具體操作過程：將分離純化的病原菌接種到PDA 液體培養基中，置于搖床中以25 ℃、120 r · min振蕩培養3 d，或在PDA 平板上25 ℃暗培養7 d，將菌體刮入無菌水中，過濾除去菌體，配制濃度為1 × 10個 · mL的孢子懸浮液。待番茄幼苗2～3 片真葉完全展開時，用清水將根系清洗干凈，放在孢子懸浮液中進行浸根接種處理15 min，然后移栽至滅菌基質中，對照組用清水浸根15 min，接種后置于18～22 ℃室內環境中，16 h · d光照條件下培養。接種處理3～4 周后，觀察、記錄材料的發病情況。除浸根法外，研究者還探索了莖基部注射接種法（姜景彬等，2018）、棉球接種法（李景富 等，2018）和灌根法（李瀟 等，2019）。王夢蕊等（2022）研究發現，采用不同的人工接種方法番茄頸腐根腐病的發病情況有所不同。浸根法和灌根法相較于注射法效果較好，浸根法操作技術要求相對較低，菌液可以多次使用，對菌液量要求少，適合大規模的抗性資源篩選；而灌根法是在前人研究的基礎上進行了改良，對植株根系進行處理后使其存在傷口而更容易被病原菌侵染，該方法省時省力，但對菌液量要求極大，適合對少量材料進行接種鑒定；注射法操作技術要求較高，且病情指數不同重復間偏差較大，推測可能是因為注射進幼苗莖基部的菌液溢出，導致無法定量每個單株注射的菌液量，從而影響試驗結果，另外不同操作者的接種效果也可能不同，因此該方法并不適合大批量材料的鑒定。

5 番茄抗頸腐根腐病的遺傳學研究進展

番茄頸腐根腐病侵染周期相對較長，目前還沒有十分安全有效的防治方法（Liu et al.，2010），所以對于該病害最科學有效的防治方法就是選育抗病品種。已有研究表明，番茄頸腐根腐病抗性來源于野生秘魯番茄（）材料PI126944、PI128650 和PI126926，由顯性單基因控制，該基因已被定位到9 號染色體上（Vakalounakis，1988；Laterrot &Moretti，1991；Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999），并且被轉育到栽培番茄中（Scott &Jones，2000）。日本研究者利用PI126944 將其抗性轉育至栽培番茄IRB#301 中（Yamakawa &Nagata，1975），法國研究者利用PI126926 育成了抗性栽培番茄Moperou（Elkind et al.，1988），而美國研究者利用IRB#301育成了抗性栽培番茄Fla.7226、Fla.7464、Fla.7775和Fla.7781 等（Scott &Jones，2000）。近年來，國外先后選育了多個抗病番茄品種，如以色列海澤拉種子公司的羅拉、圣羅蘭、安納西，美國圣尼斯種子公司的SV4224TH 等；然而國內在番茄抗頸腐根腐病品種選育方面研究比較緩慢，目前在生產上尚沒有綜合農藝性狀表現優良的抗病品種（劉蕾和王輝，2016）。程琳等（2016）利用人工接種鑒定病原菌的方法對25 份番茄種質材料進行抗病性鑒定，確定了其中對頸腐根腐病表現抗性的21 份材料，這些材料可用于今后的番茄抗病育種工作中。

國外研究者在基因的遺傳定位和分子標記的開發方面做了很多工作。Vakalounakis 等（1997）研究認為，番茄抗頸腐根腐病基因與抗煙草花葉病毒基因-連鎖，二者遺傳距離為（5.1 ±1.07）cM。隨 后，Fazio 等（1999）確定了9 號染色體上與分子標記的遺傳順序為TG101-UBC655-UBC116-UBC194-，但由于UBC194為RAPD 標記，檢測結果不易區分，且與基因距離為5.1 cM，因此其應用受到了一定的限制（Tanyola? &Akkale，2010）。Staniaszek 等（2014）將距離基因約3 cM 的C2_At2 g38025 標記改造成了CAPS 標記C2-25，該標記在番茄頸腐根腐病抗病材料的分子輔助選擇中得到了一定的應用（程琳 等，2016，2021；劉蕾 等，2018），然而王夢蕊等（2022）采用100 份不同背景來源的番茄種質材料進行驗證，該標記的吻合率僅為59%，與程琳等（2016）采用25 份材料驗證的吻合率100%差距較大，其原因可能在于程琳等（2016）試驗中所檢測的材料均引自荷蘭，其遺傳背景較為單一，因此分子標記檢測結果與人工接種鑒定結果高度吻合，而王夢蕊等（2022）所用試驗材料為收集保存的自然群體及不同來源的新品種，遺傳背景較為復雜，因此該標記準確率較低。Mutlu 等（2015）利用只攜帶基因，而不含-基因的材料Fla.7781構建群體，篩選獲得了1 個SCAR 標記SCAR，該標記距離基因僅0.016 cM，位于9 號染色體的61.78 Mb 位置，與標記C2-25 的物理位置（5.49 Mb）較遠，然而在43 份商品種番茄材料中驗證其準確率不到45%（Kim et al.，2016）。在王夢蕊等（2022）的驗證試驗中，該標記的準確率也僅有51%，表明該標記不適用于抗頸腐根腐病的輔助選擇育種。Kim 等（2016）篩選了2 個與連鎖的分子標記PNU-T1212（5.1 Mb）和PNU-D4（6.1 Mb），在F群體中的準確率分別為93.2%和92.8%，但在60 份商品種番茄材料中的準確率約為60%和90%。在王夢蕊等（2022）的驗證試驗中，標記PNU-D4 的準確率為83%。Devran 等（2018）通過基因組重測序和生物信息學分析將基因定位在9 號染色體4.2～5.1 Mb 范圍內，并分析了定位區間內的注釋基因，但該研究并沒有預測或驗證候選基因功能。到目前為止，對于基因的定位和分子標記的應用，不同研究者的試驗結果并不一致，因此還需進一步加強基因的定位克隆和分子標記開發研究工作。

6 展望

番茄頸腐根腐病病原菌與番茄枯萎病病原菌相比，雖然同為尖孢鐮刀菌，但其寄主范圍更廣，危害范圍更大。對此，番茄生產者應給予高度重視，特別是要注意合理安排不同作物的換茬輪作。近年來，我國設施番茄栽培面積逐年增大且往往連續種植，該病一旦流行將會給番茄生產造成嚴重損失，應密切監測頸腐根腐病在番茄主栽區的發生、發展情況，為該病害的發生做好預防和控制工作。

目前，我國在番茄抗頸腐根腐病方面的研究相對薄弱，主要集中在病原菌鑒定和病害防治方面，在遺傳學研究方面基本處于空白，因此極大地阻礙了番茄抗頸腐根腐病的育種進程。另有研究表明，較早應用到抗病育種中的秘魯番茄PI128650同時攜帶有抗病基因-和，對348 份栽培番茄材料基因組重測序顯示，其中20 份材料攜帶有秘魯番茄9 號染色體上長約50 Mb 的片段，該外源野生片段占據了9 號染色體的大部分區域（Lin et al.，2014）。由于野生番茄和栽培種番茄存在結構變異（Seah et al.，2004；Ji et al.，2007），在長期的自交和回交選育過程中，該外源片段依舊沒有完全被打斷，這種情況可能會導致在番茄抗煙草花葉病毒病和頸腐根腐病育種中產生很多不良性狀，比如某些攜帶-抗性基因的番茄材料會表現為植株長勢較弱，葉片發黃等（崔麗朋 等，2017）。抗性基因連鎖累贅是培育優質多抗番茄品種的主要障礙，這可能是目前生產上沒有綜合農藝性狀表現優良的抗頸腐根腐病番茄品種的重要原因之一。如何通過全基因組分子設計育種和利用分子標記輔助選擇打破抗病基因連鎖累贅，是現今培育優質多抗番茄品種的重點和難點，研究者應加強抗病基因的定位和克隆等工作，為番茄抗病新品種的培育奠定基礎。