氯硝柳胺抑制紫杉醇耐藥性三陰性乳腺癌效果及作用機制的實驗研究

葉玉萍 林崇峰 鄭楠

乳腺癌是當前女性中發病率第一位的惡性腫瘤，2018年，全球有200萬例乳腺癌被確診[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中最具侵襲性的組織學亞型，其對化療的反應小，總體預后不良，缺乏常規的靶向治療方法[2-3]。當前乳腺癌的治療策略包括手術切除、放療、化療等。然而，化療和放療存在嚴重的不良反應，會降低患者的生活質量[4]。較多的乳腺癌患者對紫杉醇初始化療沒有反應，或者在隨后的治療中發生獲得性耐藥和交叉耐藥，患者預后較差，死亡率較高[5-7]。因此，探尋TNBC的新療法、增效劑或者輔助藥物聯合治療以提高療效意義重大。

研究發現，在耐藥性結腸癌細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase,PI3K）途徑被異常激活，且與耐藥細胞的惡性侵襲表型有關[8]。在TNBC中，PI3K相關信號通路可以通過受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase,RTK）信號傳導在細胞生長和存活的調節之間發揮重要作用[9-10]。PI3K下游最相關的節點是蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和哺乳動物雷帕霉素靶標蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR），該途徑受多種磷酸酶的調節，包括磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）以及ⅡB型肌醇多磷酸-4-磷酸酶（inositol polyphosphate 4-phosphatasetypeⅡ,INPP4B），從而驅動腫瘤的發展和對化療的抵抗[11]。有研究指出，常用抗寄生蟲藥物氯硝柳胺具有一定的抗腫瘤活性，可以保護機體免受致癌因素的損傷，同時可抑制腎癌的侵襲和遷移[12]，其作用機制可能與氯硝柳胺通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導癌細胞凋亡有關[13]。氯硝柳胺是否可以抑制紫杉醇耐藥性TNBC的發展以及其作用機制均尚未清楚。基于此，本研究通過細胞和動物實驗來探討氯硝柳胺抑制紫杉醇耐藥性TNBC的效果，并分析可能的作用機制，以期為臨床治療TNBC提供參考，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇耐藥性TNBC細胞株MDA-MB-231購自北京泓信干細胞生物技術有限公司。

1.2 主要試劑 氯硝柳胺購自佛山信航生物科技有限公司（規格：50 mg/支），紫杉醇購自曼思特生物有限公司（規格：20 mg/支，批號：33069-62-4），PI3K/Akt通路抑制劑LY294002購自賽多利斯生物試劑公司（規格：20 mg/支），GAPDH一抗（規格：100 μl/支）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗（規格：100 μl/支）購自美國Sigma公司。PI3K一抗（規格：200 μl/支）、磷酸化PI3K（phospho-phosphoinositide-3-kinase，p-PI3K）一抗（規格：100 μl/支）購自維潤賽潤生物試劑有限公司。磷酸化Akt（phospho-protein kinase B，p-Akt）一抗（規格：100 μl/支）、Akt一抗（規格：100 μl/支）購自美國 CST公司，P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）（規格：100 μl/支）購自博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 MDA-MB-231細胞株使用添加10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養，將細胞放在37℃和5%CO2的恒溫恒濕培養箱中培養，培養至細胞80%融合后行Western blot法檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達水平。

1.3.2 細胞分組和細胞增殖能力檢測 將耐藥性MDA-MB-231細胞接種在96孔板中并分為3組，對照組使用紫杉醇（1 μmol/L）處理，氯硝柳胺組使用氯硝柳胺（3 μmol/L）處理，聯合用藥組使用氯硝柳胺（3 μmol/L）+LY294002（1 μmol/L）處理。各組細胞孵育12 h后按照試劑說明書使用MTT試劑進行染色，反應30 min后洗滌未結合的染料，并將染色的細胞溶解在10 mmol/L Tris（pH 10.0）中，在490 nm處檢測吸光度以反映細胞增殖能力。

1.3.3 細胞凋亡情況檢測 使用FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）按照試劑盒說明書定量確定凋亡細胞的百分比：各組細胞不同處理24 h后，將1×107個細胞與FITC標記的膜聯蛋白V和碘化丙啶（PI）試劑在室溫下于黑暗中染色15 min，洗滌后，在BDFACS Canto流式細胞儀（美國BD公司，型號：Attune NxT）上進行每個樣品的采集，并使用BDFACS Diva軟件分析收集的數據，并確定各組凋亡細胞的百分比（凋亡率）。

1.3.4 細胞遷移能力檢測 將Transwell小室置于6孔板中，6孔板中加入2 ml細胞培養液，各組細胞處理24 h后將2×104個（200 μl）細胞加入小室內，37 ℃孵育48 h，PBS洗滌3次后在含有0.1%結晶紫和20%甲醇的染料溶液中染色30 min，使用倒置顯微鏡觀察遷移細胞，隨機挑選5個視野進行拍照和計數，遷移率=藥物組遷移細胞數/對照組遷移細胞數×100%。

1.3.5 細胞PI3K/Akt通路相關蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。提取各組細胞總蛋白后，使用考馬斯亮藍法測量樣品中的蛋白質濃度，用8%～15%SDS-PAGE（美國Millipore公司）分離等量的蛋白質（520 μg），并轉移至聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司），用5%BSA（美國Sigma-Aldrich公司）封閉膜，用抗 p-Akt、抗 Akt、抗 p-PI3K、抗 PI3K、抗裂解的 Caspase-3、抗P-gp或抗GAPDH室溫孵育過夜，稀釋度為1∶500，然后用增強的化學發光（ECL）檢測試劑盒（英國GE Healthcare公司）檢測蛋白印跡反映p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt表達水平。

1.3.6 小鼠異種移植腫瘤模型建立 30只4～6周齡的雄性SD小鼠購自溫州醫科大學動物實驗中心，飼養于動物實驗中心SPF級動實驗室，自由飲食、飲水。將耐藥性MDA-MB-231細胞（1×106個細胞）懸浮在100 μl無血清培養基中，并注射到小鼠左側腹壁皮下，繼續飼養2周；當腫瘤體積達到30 mm3時，將小鼠按隨機數字表法分為3組，每組10只。對照組小鼠腹腔注射紫杉醇（10 mg/kg，溶于PBS），氯硝柳胺組小鼠腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS），聯合用藥組腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS）+LY294002（10 mg/kg，溶于 PBS），均 1次/d，共 35 d。然后每日用游標卡尺測量腫瘤大小，并計算腫瘤體積。5周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出腫瘤，稱重后以10%甲醛溶液固定。

1.3.7 小鼠腫瘤組織Ki-67表達檢測 采用免疫組化染色法。各組小鼠腫瘤組織固定48 h后使用石蠟包埋，切成2 μm切片后固定在載玻片上，與Ki-67抗體一起在含5%FBS的PBS中4℃孵育過夜。然后根據試劑盒說明書，在室溫下用稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）偶聯物孵育切片，然后使用蘇木精復染5 min，在顯微鏡下進行觀察，使用圖像分析軟件Olympus cellSens Dimension計算表達陽性率。

1.4 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組耐藥性MDA-MB-231細胞增殖能力、遷移能力和凋亡情況比較 與對照組相比，氯硝柳胺組、聯合用藥組耐藥性MDA-MB-231細胞增殖能力、遷移能力均明顯下降，細胞凋亡明顯增多，且聯合用藥組細胞增殖、遷移能力又較氯硝柳胺組明顯下降，細胞凋亡明顯增多，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖1、2、3。即氯硝柳胺抑制耐藥性MDA-MB-231細胞的體外增殖和遷移，并誘導細胞凋亡。

圖1 氯硝柳胺組、聯合用藥組、對照組耐藥性MDA-MB-231細胞增殖能力比較

圖2 氯硝柳胺組與對照組耐藥性MDA-MB-231細胞遷移能力比較（a：遷移實驗鏡下所見比較，結晶紫染色，×400；b：細胞遷移能力比較，與對照組比較，*P＜0.05）

圖3 氯硝柳胺組與對照組耐藥性MDA-MB-231細胞凋亡情況比較（a：流式細胞圖比較；b：細胞凋亡情況比較，與對照組比較，*P＜0.05）

2.2 3組耐藥性MDA-MB-231細胞PI3K/Akt通路相關蛋白表達水平比較 與對照組相比，氯硝柳胺組、聯合用藥組耐藥性MDA-MB-231細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達水平均下降，裂解的Caspase-3蛋白表達水平均上升，P-gp蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見圖4、5。即氯硝柳胺處理細胞后，細胞中PI3K/Akt通路的磷酸化水平被明顯抑制，和LY294002聯合用藥可以進一步抑制PI3K/Akt通路的激活，并導致細胞中耐藥標志物水平降低與細胞凋亡標志物水平上升。

圖4 氯硝柳胺組、聯合用藥組、對照組耐藥性MDA-MB-231細胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達水平比較（a：蛋白表達電泳圖；b：蛋白磷酸化表達水平比較，與對照組比較，*P＜0.05）

圖5 氯硝柳胺組、聯合用藥組、對照組耐藥性MDA-MB-231細胞裂解的Caspase-3、P-gp蛋白表達水平比較（a：蛋白表達電泳圖；b：蛋白磷酸化表達水平比較，與對照組比較，*P＜0.05）

2.3 3組小鼠移植腫瘤體積比較 5周后，與對照組比較，氯硝柳胺組、聯合用藥組小鼠移植腫瘤體積均縮小，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6（插頁）。

圖6 氯硝柳胺組、聯合用藥組、對照組小鼠移植腫瘤體積比較（a：腫瘤生長曲線比較，與對照組比較，*P＜0.05；b：腫瘤肉眼所見比較）

2.4 3組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達情況比較 與對照組比較，氯硝柳胺組、聯合用藥組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖7。

圖7 氯硝柳胺組、聯合用藥組、對照組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達情況比較（a：Ki-67表達情況鏡下所見，×400；b：Ki-67表達陽性率比較，與對照組比較，*P＜0.05）

3 討論

TNBC是常見的女性惡性腫瘤之一，我國乳腺癌的發病率不斷上升，每年新發患者約36.9萬例，其發病逐漸呈現年輕化趨勢。由于TNBC的復發、轉移等特性，以及獲得性耐藥、多重耐藥性等問題，TNBC的臨床治療手段例如手術切除、化療、放療等效果欠佳[14]。因此，闡明其耐藥機制并尋找有效的化療藥物具有重要的臨床意義。本研究結果顯示，在體外細胞培養和體內動物模型中，氯硝柳胺均具有良好的抗腫瘤活性，可以有效的抑制耐藥性TNBC的體內外進展。耐藥性乳腺癌具有高度耐藥以及向身體其他器官轉移的潛力，是引起女性癌癥死亡的重要因素[15]。研究表明，乳腺癌的侵襲性和高度轉移性特征與PI3K/Akt轉導通路的異常激活有關[16]。氯硝柳胺也稱滅絳靈、貝螺殺，是一種水楊酰胺類衍生物，其作用機制為抑制蟲體細胞內線粒體氧化磷酸化過程，能量物質ATP生成減少。近年來的研究表明氯硝柳胺具有廣泛的藥理活性，包括抗癌、抗菌及抗纖維化等作用[17-18]，可通過激活Caspase-8/t-Bid線粒體途徑誘導乳腺癌細胞的凋亡，發揮抗乳腺癌作用，并通過JAK/STAT3信號通路的調節而誘導癌細胞自噬，發揮化療增敏作用。本研究使用氯硝柳胺對耐藥性MDA-MB-231細胞進行處理，結果顯示，耐藥性MDA-MB-231細胞中PI3K/Akt信號轉導被明顯抑制，耐藥蛋白表達降低，細胞增殖與侵襲能力被顯著抑制，且細胞凋亡明顯增加，并表現為凋亡相關蛋白的明顯上調。PI3K/Akt通路廣泛參與各種細胞過程，例如細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡，在血管生成和轉移過程中起著至關重要的作用，與乳腺癌的發展、侵襲以及化療耐藥密切相關[19]。而在聯合使用PI3K抑制劑之后，氯硝柳胺誘導的信號通路抑制和抗癌活性被進一步增加，提示氯硝柳胺可以部分地通過PI3K/Akt信號抑制而發揮抗癌活性，體內實驗則進一步證實，氯硝柳胺可通過PI3K/Akt信號抑制耐藥性腫瘤的體內進展。

總之，本研究結果表明，氯硝柳胺通過PI3K/Akt信號轉導而抑制耐藥性TNBC細胞的侵襲和增殖，并誘導細胞凋亡，進而抑制腫瘤的體內進展。