胰高血糖素樣肽1受體在子宮內膜癌中的表達及意義研究

李武 劉松君 阮凡 呂雯

子宮內膜癌（endometrial cancer,EC）是繼卵巢癌之后第二常見的婦科惡性腫瘤。近年來，EC不僅全球發病率有所上升，而且患者的發病年齡也逐漸年輕化。EC的進展是一個復雜的過程，涉及多個因素和步驟。雌激素長期刺激子宮內膜和（或）缺乏孕激素拮抗作用被認為是導致子宮內膜增生和發生癌變的主要因素。此外，還有多種誘發EC的危險因素，如高血壓、肥胖和糖尿病。臨床上，EC的治療仍以手術結合輔助治療（如化療、內分泌治療）為主，然而多年來患者總體生存率并沒有顯著提高。此外，晚期或復發EC患者由于出現化學藥物抵抗，臨床預后不良。因此，探討EC的發病機制，闡明EC細胞在惡變過程中的生物學行為具有重要意義。為EC的分子生物學診斷、靶向治療和預后監測尋找新的、有效的特異性生物標志物，是當前研究熱點[1-3]。由胰高血糖素樣肽1受體（glucagon-like peptide 1 receptor,GLP1R）基因編碼的七跨膜蛋白—GLP1R蛋白可以刺激胰島素分泌[4]。研究發現，GLP1R基因的多態性與糖尿病相關[5]，GLP1R蛋白參與能量代謝、G蛋白偶聯受體通路等[6-7]。有學者發現，GLP1R表達上調可抑制前列腺癌發生、發展[8]。基于此，本研究分析GLP1R在EC組織、細胞中的表達情況，并探討GLP1R對EC細胞活力的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 組織標本和細胞 選取2019年至2020年在浙江省立同德醫院行手術治療的EC患者5例，收集其手術切除標本中的病變子宮內膜組織和配對的正常子宮內膜組織。患者均為初次治療、術前未接受過內分泌治療且無其他腫瘤病史。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（批件號：2019038），患者知情同意并簽署知情同意書。5種人EC細胞系分別為HEC-1A（武漢普諾賽生命科技有限公司）、RL95-2（上海中科院細胞庫）、KLE（武漢普諾賽生命科技有限公司）、Ishikawa（南京科佰生命科技有限公司）和AN3CA（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EC細胞培養 5種EC細胞均培養于含10%FBS、100 U/ml青霉素和 100 U/ml鏈霉素的DMEM培養基（北京Hyclone公司，批號：SH30243.01B）中，置于37℃、5%CO2飽和濕度環境中培養。

1.2.2 EC組織或細胞GLP1R mRNA表達水平檢測采用RT-qPCR法。將組織或細胞均質破碎，然后加至1 ml Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：3180310）中裂解5 min，離心后去除上清液。紫外分光光度計測定 1 μl RNA 的 OD260和 OD280，計算 RNA 純度和濃度。在由 1 μl primescript酶混合物、1 μl RTprimer混合物、4 μl 5× primescript緩沖液、2.7631 μg RNA 和 Rnase free H2O組成的逆轉錄系統中，將RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄反應程序如下：37℃15 min；85℃5 s；4℃保持。采用RT-qPCR法檢測1 μl正向引物、1 μl反向引物、10 μl 2×混合物、7 μl H2O和1 μl cDNA 反應系統中的mRNA表達水平。RT-qPCR程序如下：95℃10 min 1個循環；40個循環（95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s），65℃～95℃0.5℃/5 s 1個循環。引物序列如下：GLP1R正向5'-TCGCTGTGAAAATGAGGAGG-3'，反向 5'-TTGGCTGAGGTTAGAAGAGCC-3'；GAPDH正向 5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，反向 5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。GLP1R mRNA 表達水平采用 2-ΔΔCt法定量。

1.2.3 EC組織或細胞GLP1R蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。裂解后的組織或細胞于4℃14 000 r/min離心15 min，收集上清液。根據裂解液的體積加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。然后，樣品通過10%SDS-PAGE電泳分離并轉移到PVDF膜上。取出PVDF膜，用5%牛奶/TBST室溫密封1 h。該膜與針對GLP1R（武漢Proteintech公司）和GAPDH（武漢AtaGenix公司）的一抗在4℃下孵育過夜。PVDF膜與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗兔二抗（武漢Proteintech公司）一起孵育，室溫下用5%牛奶/PBST稀釋1 h。PVDF膜暴露于發光試劑2 min。用凝膠成像系統觀察蛋白質條帶。

1.2.4 EC組織GLP1R蛋白表達定性檢測 采用免疫組化法。EC組織和正常組織石蠟包埋切片，用水脫石蠟。抗原修復后，將切片置于3%過氧化氫溶液中，室溫孵育25 min，避光。洗滌后，切片用3%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）（北京 Solarbio公司）室溫封閉30 min。切片中加入一定比例的一抗的PBS（美國Life公司），4℃孵育過夜。將載玻片置于PBS中并在脫色振蕩器上振蕩洗滌3次，5 min/次。將切片與HRP標記的二抗（武漢Proteintech公司）在室溫下孵育50 min。DAB（美國DAKO公司）顯影后，切片用HE染色液復染3 min。切片用1%鹽酸乙醇分化20 s，氨水變藍。切片脫水并用中性樹膠封片，獲取并分析圖像。

1.2.5 細胞轉染 吸出原始培養基后，將AN3CA細胞加入PBS并用胰蛋白酶消化2 min。使用移液管制備單個細胞。20 μl細胞懸液加入20 μl臺盼藍試劑計數。剩余的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，將細胞重新懸浮在培養基中。然后，將細胞懸液接種到6孔板（3×105個細胞/孔）中并培養過夜。1.5 μl 20 μmol/L 3種靶向GLP1R的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）通過 100 μl opti-MEM 孵育 5 min。將 7.5 μl Lipofectamine RNAMAX試劑（美國Thermo Fisher公司，批號：CN2515133）添加到opti-MEM中并孵育5 min。siRNA混合物通過Lipofectamine混合物孵育5 min。此外，AN3CA細胞用100 nmol/L胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide 1,GLP-1）類似物exendin-4處理。采用RT-qPCR法檢測AN3CA細胞GLP1R mRNA表達水平，具體方法同1.2.2。

1.2.6 轉染后細胞活力檢測 采用CCK-8檢測試劑盒（日本Dojindo公司批號：GX735）檢測細胞活力。將100 μl細胞懸液加入96孔培養板（4 500個細胞/孔）中，在 37 ℃、5%CO2培養箱中培養。在 0、24、36、48和72 h檢測細胞存活率，具體為每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育3 h，加入終止液后用微孔板檢測器檢測OD450。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。每個實驗重復3次。計量資料兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方法分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC組織與正常子宮內膜組織GLP1R mRNA、蛋白表達水平比較 EC組織GLP1R mRNA、蛋白表達水平均高于正常子宮內膜組織（均P＜0.05）。免疫組化檢測顯示，GLP1R蛋白主要在腫瘤細胞膜上表達。即EC組織中GLP1R表達上調，見圖1（插頁）。

圖1 EC組織與正常子宮內膜組織GLP1R mRNA、蛋白表達水平比較（a：mRNA表達水平比較；b：蛋白表達電泳圖比較；c：蛋白表達水平比較；d：蛋白表達鏡下所見比較，免疫組化染色，×100）

2.2 不同EC細胞GLP1R mRNA、蛋白表達水平比較 5種EC細胞（HEC-1A、RL95-2、KLE、Ishikawa和AN3CA）中，AN3CA細胞GLP1R mRNA、蛋白表達水平高于其他4種細胞（均P＜0.05）。因此，本研究選擇AN3CA細胞進行細胞轉染。轉染siRNA的AN3CA細胞GLP1R mRNA表達水平均低于未轉染的AN3CA細胞（對照組）（均P＜0.05），且轉染siRNA-1的 AN3CA細胞表達水平最低（均P＜0.05）；為激活GLP1R表達，AN3CA細胞用GLP-1類似物exendin-4處理，處理后，AN3CA細胞GLP1R mRNA表達水平明顯高于對照組細胞（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同EC細胞GLP1R mRNA、蛋白表達水平比較（a：5種EC細胞GLP1R mRNA表達水平比較；b:5種EC細胞GLP1R蛋白表達電泳圖比較；c：5種EC細胞GLP1R蛋白表達水平比較；d：轉染不同siRNA的AN3CA細胞GLP1R mRNA表達水平比較；e：轉染siRNA后的AN3CA細胞與exendin-4處理的AN3CA細胞GLP1R mRNA表達水平比較）

2.3 轉染siRNA后的AN3CA細胞與exendin-4處理的AN3CA細胞活力比較 在0 h，轉染siRNA后的與或exendin-4處理的AN3CA細胞存活率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。在 24 h，exendin-4處理的AN3CA細胞存活率高于對照組細胞（P＜0.05）。在36 h，轉染siRNA后的AN3CA細胞存活率低于轉染siNC（陰性對照）的AN3CA 細胞（P＜0.05）。在48、72 h，exendin-4處理的AN3CA細胞存活率高于對照組（均P＜0.05），轉染siRNA后的AN3CA細胞存活率低于轉染siNC（陰性對照）的AN3CA細胞（均P＜0.05），即GLP-1類似物提高了AN3CA細胞的存活率，敲低GLP1R基因表達對細胞活力起抑制作用。見圖3。

圖3 轉染siRNA后的AN3CA細胞與exendin-4處理的AN3CA細胞活力比較（a：0 h時細胞活力比較；b：24 h時細胞活力比較；c：36 h時細胞活力比較；d：48 h時細胞活力比較；e：72 h時細胞活力比較）

3 討論

目前，EC的發病機制尚不明確。探討EC的臨床創新治療策略有重要意義[9]。本研究結果顯示EC組織中GLP1R表達上調，對EC發揮致癌作用。敲低GLP1R基因表達對細胞活力起抑制作用。相反，GLP1R表達上調促進EC細胞活力。這說明，GLP1R對EC的發生、發展起促進作用。

本研究發現EC組織中GLP1R表達上調，提示GLP1R對EC具有致癌作用。現有研究已在前列腺癌、乳腺癌等中發現GLP1R過表達[10-11]。GLP1R主要分布在EC細胞的細胞膜上[12]。本研究進一步分析了GLP1R在AN3CA細胞中的生物學功能。持續增殖是EC細胞的特征。GLP1R表達上調的促增殖和GLP1R表達下調的抗增殖都可以誘導不受控制的細胞增殖并呈現無限增殖。沉默GLP1R延緩了AN3CA細胞的細胞增殖能力。相反，GLP-1類似物exendin-4會促進AN3CA細胞增殖。前期研究發現，GLP1R激活降低了前列腺癌細胞和卵巢癌細胞的增殖能力[13-14]。細胞周期變化是影響腫瘤進展的關鍵因素。細胞周期停滯導致細胞周期延長，腫瘤細胞增殖勢必受到影響。已有研究顯示，exendin-4提高了卵巢癌、結腸癌和胰腺癌細胞的細胞凋亡[14-16]。本研究結果顯示，敲低GLP1R基因表達顯著增加了AN3CA細胞的凋亡水平，而exendin-4降低了AN3CA細胞的凋亡水平。

EC的侵襲增加了腫瘤進展和患者死亡的風險。腫瘤轉移也導致EC的高死亡率[17-18]。一些患者在確診時已經轉移，臨床上Ⅲ期或Ⅳ期EC患者約占30%[19-20]。EC的轉移需要一系列復雜過程。首先，由于細胞間的黏附力減弱，腫瘤細胞從原位脫落，獲得遷移和侵襲能力，局部浸潤，從而侵犯血管和淋巴管，發生遠處轉移[21]。脫落的腫瘤細胞在新環境中繼發生長。Nie等[22]報道，exendin-4通過GLP1R/sirt3途徑抑制神經膠質瘤細胞遷移以及侵襲性表型。此外，Luciani等[23]發現exendin-4誘導神經母細胞瘤細胞的侵襲潛力。Cases等[24]強調了GLP1R對胰腺導管腺癌細胞遷移和侵襲的輔助作用。因此，有必要探討EC的侵襲和轉移機制，從而制定抗腫瘤轉移策略，延長患者的生存時間[25-27]。

綜上所述，EC組織和細胞中GLP1R表達上調，其表達上調促進EC細胞增殖，加速EC的進展。GLP1R可能在EC細胞中發揮致癌基因功能。GLP1R或可成為EC的生物標志物和治療EC的生物靶點。