GRIN2A、GRIN2B基因多態(tài)性與哌甲酯治療注意缺陷多動(dòng)障礙療效的關(guān)系研究

丁凱景 丁雨欽 劉艷 簡(jiǎn)鳳清 孫寧 王少華 周國(guó)嶺

注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是一種常見的神經(jīng)發(fā)育障礙，患者主要表現(xiàn)為注意力不集中、多動(dòng)和（或）沖動(dòng)[1]，其患病率幾乎沒有地域或跨文化差異，并常共病對(duì)立違抗障礙、品行障礙[2]，還可能共病特定學(xué)習(xí)障礙、破壞性心境失調(diào)、間歇性暴怒障礙、焦慮障礙、重性抑郁障礙等疾病[1]，全球兒童青少年患病率約為5.29%，成人患病率約為4.4%[3]。ADHD對(duì)患者的教育、生活、工作等多項(xiàng)個(gè)人發(fā)展問題影響深遠(yuǎn)，造成家庭、社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)，是一項(xiàng)重要的公共衛(wèi)生課題。遺傳基因在ADHD和共患疾病的病因?qū)W中起到至關(guān)重要的作用。既往家系、寄養(yǎng)子、雙生子研究表明，ADHD有家族聚集性，其遺傳度大約為74%，因此，遺傳因素是ADHD的發(fā)病機(jī)制之一[4]。然而，目前對(duì)與ADHD直接相關(guān)的特異性基因以及具體遺傳模式的研究較少。本研究選取谷氨酸能系統(tǒng)候選基因N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）亞基NMDA2A基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，GRIN2A）和NMDA2B基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B,GRIN2B）的2個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms,SNPs）進(jìn)行研究，探討候選基因多態(tài)性與ADHD興奮劑哌甲酯藥物治療療效的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 納入2016年2月至2019年2月在杭州市第七人民醫(yī)院兒童心理科門診就診及住院的6～15歲且符合《美國(guó)精神疾病診斷統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition，DSM-5）診斷標(biāo)準(zhǔn)的ADHD患兒80例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）中國(guó)修訂韋氏兒童智力測(cè)驗(yàn)（Chinese Wechsler intelligence scale for children,C-WISC）＜70分；（2）目前或既往符合精神分裂癥、自閉癥譜系障礙、情緒障礙、抽動(dòng)穢語綜合征、癲癇及其他器質(zhì)性精神疾病者。剔除因嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)脫落的4例（反復(fù)嘔吐2例、嚴(yán)重失眠1例、易激惹1例），失聯(lián)2例，最終納入74例，其中男57例，女17例，中位年齡10（8，11）歲。本研究經(jīng)杭州市第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法 使用自制臨床信息調(diào)查表進(jìn)行基本資料的收集。由2位主治及以上的兒童精神科醫(yī)師以DSM-5診斷標(biāo)準(zhǔn)確診ADHD[1]。采用SNAP-Ⅳ兒童注意力量表評(píng)估ADHD患兒的嚴(yán)重程度并進(jìn)行亞型分類[5]，采用C-WISC、Conners父母評(píng)癥狀量表（Conners parent symptom questionnaire,PSQ）、注意力競(jìng)量測(cè)驗(yàn)（the test of variables of attention,T.O.V.A.）等評(píng)估工具，對(duì)患兒進(jìn)行認(rèn)知、行為、注意力的系統(tǒng)測(cè)評(píng)。

其中，SNAP-Ⅳ有26項(xiàng)條目，包含注意缺陷分量表（第1～9題）、多動(dòng)沖動(dòng)分量表（第10～18題）、對(duì)立違抗分量表（第19～26題），由患兒父母填寫。PSQ量表有48項(xiàng)條目，包含沖動(dòng)多動(dòng)、品行問題、多動(dòng)指數(shù)、學(xué)習(xí)問題、心身障礙和焦慮6個(gè)因子，由患兒父母填寫。T.O.V.A.是一種持續(xù)性操作測(cè)驗(yàn)，包含理解力商數(shù)、控制力商數(shù)、注意力商數(shù)、多動(dòng)商數(shù)值等指標(biāo)。

在藥物治療前、治療8周后進(jìn)行療效及不良反應(yīng)評(píng)估，并記錄上述神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)及量表評(píng)分。根據(jù)既往文獻(xiàn)，設(shè)定哌甲酯治療8周后SNAP-Ⅳ的注意缺陷與多動(dòng)沖動(dòng)分量表共18項(xiàng)條目減分率≥30%者為治療有效者，對(duì)立違抗分量表8項(xiàng)條目減分率≥30%者為對(duì)立違抗改善者[6]。

1.3 基因檢測(cè) 所有入組患兒在治療前均抽取外周靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管-20℃冰箱保存，抽提樣本DNA[血液基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司]，采用紫外分光光度法進(jìn)行DNA濃純度測(cè)定，保存于-80℃冰箱備用。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物信息情報(bào)中心檢索dbSNP數(shù)據(jù)庫（Datebase of Single Nuleotide Polymorphisms,dbSNP）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）以及既往文獻(xiàn)[7-8]，選取GRIN2A rs2229193和GRIN2B rs2284411作為候選基因位點(diǎn)，以及設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（GRIN2B基因：5'-ACGTTGGATGATGACATCATCAGT GTCTGC-3'and 5'-ACGTTGGATGCATGACTTTTTTCC CCTACTC-3'，GRIN2A 基因：5'-ACGTTGGATGTTGAC GAACTTCCGACATGG-3'and 5'-ACGTTGGATGCGTCATCGTGGAAGACATAG-3'）。使用SNP基因分型試劑盒（40×TaqMan?SNP Genotyping Assay Mix，美國(guó)ABI公司）及萬能PCR液[Premix Ex TaqTM，寶生物工程（大連）有限公司]，在ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，PCR循環(huán)參數(shù)：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，讀取反應(yīng)后的熒光數(shù)據(jù)，利用內(nèi)置軟件進(jìn)行等位基因分型。采用PCR凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并隨機(jī)選取兩個(gè)樣本測(cè)序驗(yàn)證多態(tài)性與實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Haploview軟件進(jìn)行候選基因多態(tài)位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)和連鎖不平衡分析。采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，候選基因SNPs基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律（P＞0.05）。樣本有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。

2.2 不同基因型ADHD患兒治療前癥狀的比較GRIN2A基因G/G基因型60例，G/A基因型14例，無A/A基因型。GRIN2B基因C/C基因型55例，T/C基因型18例，T/T基因型1例。

GRIN2A基因G/A+A/A基因型患兒的SNAP-Ⅳ對(duì)立違抗分量表得分、PSQ品行問題項(xiàng)目得分均較G/G基因型患兒高（均P＜0.01），兩種基因型患兒在SNAP-Ⅳ其他分量表得分、C-WISC得分、PSQ其他項(xiàng)目得分、T.O.V.A.得分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。GRIN2B基因T/C+T/T基因型患兒的SNAP-Ⅳ注意缺陷分量表得分較C/C基因型患兒更高（P＜0.05），而在SNAP-Ⅳ其他分量表得分、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.得分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 不同基因型ADHD患兒治療前癥狀的比較（分）

2.3 不同療效患兒基因型頻率的比較 74例患兒中治療有效49例，治療無效25例。治療有效和治療無效患兒間GRIN2A基因G/A+A/A基因型頻率與G/G基因型頻率、GRIN2B基因T/C+T/T基因型頻率與C/C基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同療效患兒基因型頻率的比較[例（%）]

74例患兒中對(duì)立違抗改善49例，對(duì)立違抗未改善25例。對(duì)立違抗改善與未改善患兒的GRIN2A基因G/A+A/A基因型頻率與G/G基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而GRIN2B基因T/C+T/T基因型頻率和C/C基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同對(duì)立違抗療效患兒基因型頻率的比較[例（%）]

3 討論

既往ADHD的遺傳易感性和藥物基因組研究多集中于多巴胺能、去甲腎上腺素能系統(tǒng)，但越來越多的研究開始關(guān)注谷氨酸能的作用。對(duì)ADHD患兒和成人患者的影像學(xué)研究顯示，其大腦前額葉和紋狀體中的谷氨酸鹽/谷氨酰胺水平升高[9]；哌甲酯治療會(huì)改變幼年大鼠前額葉皮層的NMDAR組成和突觸可塑性[10]，選擇性激活或抑制NMDAR介導(dǎo)的突觸后電流，調(diào)節(jié)認(rèn)知增強(qiáng)作用或精神癥狀誘導(dǎo)。因此，前額葉中功能失調(diào)的谷氨酸系統(tǒng)可能是ADHD表型的關(guān)鍵因素；谷氨酸受體基因可能在兒童多動(dòng)癥治療響應(yīng)藥物療效過程中發(fā)揮重要作用。

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的一種氨基酸類興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種重要功能的調(diào)節(jié)[11]。谷氨酸在ADHD發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。既往研究顯示，ADHD患兒大腦前扣帶皮層中谷氨酸代謝顯著增加[12]。ADHD大鼠模型也發(fā)現(xiàn)了前額葉紋狀體中谷氨酸代謝水平的紊亂[13]。NMDAR不僅能幫助調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及參與突觸可塑性的形成，并且對(duì)神經(jīng)元回路的形成亦起著關(guān)鍵的作用，在學(xué)習(xí)和記憶過程中也是一類至關(guān)重要的受體[14]。

鹽酸哌甲酯是治療ADHD的經(jīng)典藥物之一，一般認(rèn)為它是通過阻斷突觸前神經(jīng)元的去甲腎上腺素和多巴胺再攝取，以及增加這些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙，實(shí)現(xiàn)對(duì)ADHD的治療作用，但具體機(jī)制尚不明確。哌甲酯治療會(huì)改變幼年大鼠前額葉皮層的NMDAR組成和突觸可塑性[10]，選擇性激活或抑制NM-DAR介導(dǎo)的突觸后電流調(diào)節(jié)認(rèn)知增強(qiáng)作用或精神癥狀誘導(dǎo)。因此，前額葉中功能失調(diào)的谷氨酸系統(tǒng)可能是ADHD表型的關(guān)鍵因素。谷氨酸受體基因可能在兒童多動(dòng)癥治療響應(yīng)哌甲酯療效中發(fā)揮作用[15-16]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study,GWAS）研究顯示，離子型谷氨酸受體變異與多動(dòng)癥有關(guān)。谷氨酸離子型受體紅藻氨酸型亞基4（glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 4,GRIK4）基因rs655824位點(diǎn)的變異、谷氨酸離子型受體delta型亞基 2（glutamate ionotropic receptor delta type subunit 2,GRID2）基因突變?cè)诙鄤?dòng)癥的易感性中起著潛在作用[17-18]?；蚪M測(cè)序分析表明，谷氨酸鹽基因組與多動(dòng)/沖動(dòng)癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。同時(shí)具有GRIN2B基因rs2268119 A/T或T/T基因型和低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位的兒童注意力問題更多[20]。GRIN2B基因rs2284411與ADHD的注意力缺陷、沖動(dòng)多動(dòng)癥狀均有關(guān)聯(lián)[21]。GRIN2A基因5號(hào)外顯子的遺傳變異與ADHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[22]。ADHD患者GRIN2B等位基因與持續(xù)操作性測(cè)驗(yàn)（continuous performance test,CPT）的持續(xù)性正確反應(yīng)時(shí)間存在關(guān)聯(lián)，C/C亞組的持續(xù)性正確反應(yīng)時(shí)間高于C/T+T/T亞組；GRIN2A等位基因的G/G亞組比G/A+A/A亞組在CPT測(cè)驗(yàn)中存在更多的遺漏錯(cuò)誤[8]。在一項(xiàng)對(duì)187例ADHD兒童的GWAS研究中，發(fā)現(xiàn)谷氨酸代謝型受體7（glutamate metabotropic receptor 7,GRM7）基因可能與哌甲酯反應(yīng)有關(guān)[23]。經(jīng)過8周的哌甲酯治療，GRM7基因rs37952452 G/A基因型的ADHD兒童比G/G基因型攜帶者的臨床改善效果更好[15]。GRIN2B基因rs2284411位點(diǎn)C/C基因型顯示出對(duì)哌甲酯更好的治療反應(yīng)，GRIN2B基因C/C基因型在CPT響應(yīng)時(shí)間變異性上也顯示出更明顯改善，GRIN2A基因G/G基因型比G/A基因型則顯示出更明顯的CPT錯(cuò)分誤差改善[7]。GRIN2B基因與左側(cè)上頂葉簇的靜態(tài)區(qū)域同質(zhì)性均值（ReHo）有顯著的診斷和交互作用[24]。然而，在所有相關(guān)的GWAS研究中，沒有一個(gè)谷氨酸受體基因達(dá)到全基因組顯著水平。Adams等[11]研究并未發(fā)現(xiàn)GRIN2A基因與ADHD沖動(dòng)控制、認(rèn)知表型的顯著關(guān)聯(lián)；Nyman等[25]研究也并未發(fā)現(xiàn)GRIN2A多態(tài)性與ADHD的陽性結(jié)果；高雪屏等[26]研究應(yīng)用基因掃描技術(shù)，探索驗(yàn)證了GRIN2A的G1430A位點(diǎn)多態(tài)性與ADHD可能并無關(guān)聯(lián)。

本研究驗(yàn)證了ADHD患兒中GRIN2A基因A等位基因攜帶組有更多的對(duì)立違抗行為和品行問題，提示GRIN2A基因多態(tài)性可能與ADHD共病對(duì)立違抗障礙及品行障礙相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ADHD患者GRIN2B基因T等位基因攜帶組表現(xiàn)出更顯著的注意缺陷癥狀。與既往相關(guān)研究得到不一致性的結(jié)果可能與種族差異、有限的樣本量和統(tǒng)計(jì)分析方法的差異導(dǎo)致的。在大多數(shù)情況下，多動(dòng)癥是由幾種遺傳和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素引起的，每種因素都有很小的個(gè)體效應(yīng)，并共同增加了ADHD易感性。

綜上所述，GRIN2A、GRIN2B基因候選位點(diǎn)SNP在哌甲酯治療ADHD的藥物影響無明顯作用，但在對(duì)立違抗行為的組間比較中發(fā)現(xiàn)，GRIN2A基因的G/A+A/A基因型較G/G基因型有更高的SNAP-Ⅳ對(duì)立違抗分量表減分率，提示GRIN2A基因中A等位基因攜帶組在接受哌甲酯治療后，對(duì)立違抗行為顯著減少，提示GRIN2A基因多態(tài)性可能與哌甲酯改善ADHD患者對(duì)立違抗行為的療效相關(guān)。