基于高通量測序技術對不同季節圈養褐馬雞腸道菌群多樣性分析

雷 英 蘇 凱 王運盛 李金邦 張成林 李 雁 張麗霞 朱云蕓 金修哲 任倩俐 劉金鵬 普天春*

(1.太原動物園，太原，030009；2.北京動物園，北京，100044；3.北京動物園圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044)

Seasonal variation

動物機體是許多微生物的永久性宿主，微生物大多在動物胃腸道定殖，對宿主的新陳代謝和健康發揮重要調節作用[1]。越來越多的研究表明，腸道微生物群不僅參與了分解、吸收和轉化營養物質的過程，還是宿主抵御腸道病原微生物感染的天然屏障[2-3]，腸道菌群促進腸道的免疫應答，維持免疫穩態，防止病原體定殖，以此維持腸道健康[4]。腸道微生物種群之間關系有互利共生、偏利共生、拮抗和競爭等，種群結構始終處在一種動態平衡的過程中，一旦這種平衡關系被打破就會引發疾病[5]。

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)是我國特有的珍稀鳥類，隸屬于雞形目(Galliformes)雉科(Phasianidae)馬雞屬(Crossoptilon)，被列為國家一級保護動物[6]。多年來，隨著我國圈養禽類人工免疫和驅蟲工作的持續開展，傳染性疾病和寄生蟲疾病已經得到有效遏制[7-8]，但由于季節更替導致的消化道疾病，如腹瀉、消化障礙、壞死性腸炎及潰瘍性腸炎時有發生，臨床上治療難度較大，使用抗菌藥物殺滅致病菌也會破壞消化道內正常的菌群結構，導致消化功能紊亂，免疫力降低[9]。

目前，對禽類腸道菌群的研究多集中在肉雞、蛋雞和雉科鳥類等[10-11]，在野生動物領域中，圈養褐馬雞的腸道菌群研究鮮見報道。本研究通過高通量測序技術對圈養褐馬雞腸道菌群進行多樣性分析，對比不同季節腸道菌群結構的變化規律，預測潛在致病的高發時間段，為提高褐馬雞疾病防控能力和飼養管理水平提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

同等飼養條件下2.5～3.5歲的圈養褐馬雞30只，雌雄各15只，健康狀態良好，分別于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日清晨用滅菌采樣管隨機采集新鮮糞便，樣品全部采集完畢后分為4組，分別是春季組、夏季組、秋季組和冬季組，液氮中保存。

1.2 DNA提取和PCR反應

利用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(Omega，USA)提取4組褐馬雞糞便中微生物的總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA定量分析。PCR反應靶向擴增16S rDNA的V3—V4片段，PCR反應體系為Phusion?Hot start flex 2X MasterMix 12.5 μL，模板DNA 50 ng，上下游引物各2.5 μL，超純水加至25.0 μL，經過95 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min完成PCR擴增。

1.3 產物純化及文庫構建

PCR產物經過純化及定量構建文庫。擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent 2100生物分析儀和Illumina的文庫定量試劑盒上評估。

1.4 高通量測序和數據分析

全部樣本測序完成后，將得到原始數據利用Overlap技術將雙端數據拼接，進行質控、嵌合體過濾，獲得高質量的干凈數據(clean data)；再通過“去重復”等步驟，獲得單堿基精度的代表序列；使用ASVs(擴增子序列變異)的概念構建類OTU表，獲得最終的特征表及特征序列(Feature)；最后在聯川生物技術股份有限公司(LC-Bio)的生物分析平臺進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。

2 結果與分析

2.1 樣品測序有效數據統計

通過高質量數據統計，12份褐馬雞糞便共得到有效序列837 492條，序列長度為400～500 bp，特征序列為8 884個，褐馬雞糞便樣品中冬季組的特征序列數量最高，夏季組最低；重疊部分最高的是408個特征序列，最低為13個特征序列。4個組重疊部分為76個特征序列(圖1)。

圖1 不同季節褐馬雞糞便樣品中特征序列數量分布Fig.1 Distribution of feature quantity in fecal samples of Crossoptilon mantchuricum at four seasons

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性主要通過Chao1、Observed species、Goods coverage、Shannon和Simpson 5個指數反映豐富度和均勻性。本研究中，冬季組的Chao1指數最高，為1 577.5～1 770.0，豐富度最高；夏季組的Chao1指數為419.8～513.0，豐富度最低。Observed species稀釋曲線顯示，被檢出的特征序列數量由高到低依次是冬季組、秋季組、春季組、夏季組(圖2)；Shannon index稀釋曲線顯示，物種多樣性排列由高到低依次是冬季組、春季組、秋季組、夏季組(圖3)。Goods coverage是指微生物覆蓋率，數值越高，則樣本中新物種沒有被測出的概率越低，本研究中各樣本的Goods coverage指數均為1，印證了本次測序結果真實可靠。

圖2 Observed species稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of observed species

圖3 香農指數稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of Shannon index

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性是指不同組別之間的物種差異性。Beta多樣性與Alpha多樣性一起構成了總體多樣性或一定環境群落的生物異質性。通過主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)觀察樣品組別之間的差異，結果中不同顏色代表不同分組，樣品距離越近，說明樣品之間的微生物組成結構越相似，反之則差異較大。冬季組與春季組、秋季組較為接近，夏季組與其他3組均距離較遠，說明微生物菌群種類差異較大(圖4)。

圖4 PCoA分析Fig.4 Schematic diagram of PCoA analysis

非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析也可以充分地佐證上述結果。圖5中不同顏色分支代表不同的分組，聚類樹展現了樣本間的相似度，樣本間的分枝長度越短，兩樣本越相似，反之則差異較大。

圖5 UPGMA層次聚類分析Fig.5 UPGMA hierarchical cluster analysis

2.4 物種分析

特征序列是物種分類的原始文件，為了更加準確地分析物種組成，使用SILVA及NT-16S數據庫做物種分類及后續分析。根據特征序列注釋結果和各樣品特征表，獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表，并針對不同水平物種豐度表對4組樣品的腸道菌群進行物種組成及組間差異的分析，本研究重點關注門和屬水平上的變化。

2.4.1 門和屬水平上的物種分析

根據物種豐度表和物種注釋表，默認選取門和屬水平上豐度最高的30個物種分類，將各組的物種相對豐度堆疊柱狀圖形式展示(圖6，圖7)。

圖6 褐馬雞各組腸道菌群在門水平上的物種相對豐度Fig.6 Relative species abundance of intestinal flora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

圖7 褐馬雞各組腸道菌群在屬水平上的物種相對豐度Fig.7 Relative species abundance of intestinal microflora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

在門水平上，圈養褐馬雞的優勢菌群為厚壁菌門(Firmicutes，52.11%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.20%)、變形菌門(Proteobacteria，17.91%)和放線菌門(Actinobacteria，7.32%)，其中，厚壁菌門在春季組豐度最高(64.25%)，冬季組最低(40.39%)；擬桿菌門在冬季組最高(36.72%)，夏季組最低(5.63%)；變形菌門在夏季組最高(34.81%)，春季組最低(3.61%)；放線菌門在春季組最高(15.39%)，夏季組最低(1.42%)。

在屬水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group為優勢菌屬(5.56%)，其次是鏈球菌屬(Streptococcus，5.47%)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，4.74%)。鏈球菌屬在夏季組豐度最高(21.84%)，遠遠高于其他組，提示夏季消化系統疾病風險可能極大增加；脫硫弧菌屬在秋季組最低(8.77%)。值得關注的是，賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)在夏季組最高(3.84%)，而在春季組和冬季組最低(<0.01%)；作為益生菌的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)亦是如此，在夏季組占3.19%，其他組小于0.74%。

2.4.2 季節變化規律

圈養褐馬雞腸道菌群在門水平上的變化規律以春、夏、秋、冬四季依次排序，厚壁菌門呈遞減趨勢，春季組豐度最高(64.25%)，冬季組最低(40.39%)；擬桿菌門在春季組和夏季組較低，秋季組和冬季組呈遞增趨勢，冬季組豐度接近40%；變形菌門在夏季組豐度最高，差異顯著(P<0.05)；放線菌門整體豐度較低，春季組相對較高(15.39%)，其他各組均低于7%(圖8)。

圖8 褐馬雞腸道門水平優勢菌群的季節變化規律Fig.8 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

在屬水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group最為優勢，春季組至夏季組呈遞減趨勢，秋、冬組逐漸升高，冬季組達到峰值，差異顯著(P<0.05)；鏈球菌屬在夏季呈爆發式增長，其他各組均低于0.05%；脫硫弧菌屬由春季組過渡至夏季組呈下降趨勢，隨后至秋季組豐度最高，最后到冬季組略微下降(圖9)。

圖9 褐馬雞腸道屬水平優勢菌群的季節變化規律Fig.9 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

2.4.3 物種種群之間的關系

在微生態研究中，通過不同物種在各樣品中的豐度及變化關系，計算物種之間的相關性，通過一定條件的篩選，找到不同微生物類群間的相互關系(正相關或負相關)。SparCC分析是通過計算屬水平豐度top30的微生物豐度，獲得兩兩優勢菌群之間的相關性以及顯著性P值，繪制出相關性熱圖[12]。從圖10中可以看出，Rikenellaceae_RC9_gut_group與糞桿菌屬(Faecalibacterium)、脫硫弧菌屬和擬桿菌屬(Bacteroides)呈正相關性，而同鏈球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬呈負相關性；鏈球菌屬和脫硫弧菌屬、糞桿菌屬呈負相關性，同賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬則呈正相關性，這也從另一個角度印證了鏈球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬在夏季組的相對豐度高于其他3組的檢測結果。

圖10 褐馬雞腸道菌群SparCC熱圖Fig.10 SparCC network heatmap of intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum

2.4.4 潛在致病性預測

通過BugBase對4組褐馬雞腸道菌群進行潛在致病性預測，再對應之前分析得出的菌群差異，可以有效地從源頭對疾病預防及治療[13]。圖11顯示：夏季組的潛在致病性顯著高于其他組(P<0.05)，從夏季組豐度較高的種群中篩選出相關致病菌，為臨床預防及治療提供理論依據。對比上述結果，推測鏈球菌屬是導致夏季組潛在致病性明顯增高的因素之一。

圖11 褐馬雞潛在致病性預測Fig.11 Prediction of potential pathogenicity of Crossoptilon mantchuricum

3 討論

在動物個體健康狀態良好的條件下，腸道菌群的變化是個穩定且緩慢的過程，對同等飼養條件下3歲左右的圈養褐馬雞，分別于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日隨機采集新鮮糞便，試驗全程未使用任何藥物或益生菌干預，目的在于將時間間隔拉開，以便發現并研究不同季節的腸道微生物差異，同時在每個組內連續采樣3次，將組內的差異性降低，使結果更加客觀、科學和有效。

沈佳斌等[11]研究雉科鳥類腸道菌群組成后發現，在門水平上，含量最高的是變形菌門(54.66%)，其次是厚壁菌門(24.02%)和擬桿菌門(12.07%)，本研究結果顯示：圈養褐馬雞的腸道菌群中厚壁菌門(52.11%)最為優勢，其次是擬桿菌門(18.20%)、變形菌門(17.91%)。擬桿菌門對纖維素以外的其他物質的降解效果顯著[14]，而厚壁菌門的重要作用是分解纖維素類物質[15]。本研究厚壁菌門的豐度最高，這與圈養褐馬雞的飼養環境較為固定，以及飼料結構中包含大量植物纖維素有關。在屬水平上，4組中最為優勢菌均為Rikenellaceae_RC9_gut_group、鏈球菌屬和脫硫弧菌屬。

通過Alpha多樣性分析和潛在致病性預測，夏季組的腸道菌群豐富度最低，但潛在致病性最高，這點通過SparCC分析結果可以說明，鏈球菌屬在夏季組豐度最高，但是鏈球菌屬和Rikenellaceae_RC9_gut_group、脫硫弧菌屬、Ruminococcaceae_UCG-005、糞桿菌屬、擬桿菌屬等幾種相對豐度較高的菌種呈負相關關系，從微生物與環境的關系來講，鏈球菌屬與這些菌屬屬于偏害共生關系，其代謝產物改變了腸道中的環境條件，從而抑制其他微生物的生長繁殖。但同時，在夏季組，同屬于益生菌的賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬含量最高，與鏈球菌屬呈正相關關系，說明機體始終處于一種自我調節的動態平衡中，當條件致病菌處于優勢時，劣勢菌種會啟動“競爭”機制，以“努力”維持機體健康的內環境。微環境改變越明顯，競爭越激烈[16]，這樣才能維持機體能量轉化和新陳代謝的正常需求。