黑水雞棘口吸蟲病的臨床案例與病原分子生物學鑒定

黃瀟航 彭佳佳 陳 榕 李詩藝 張 龍 賀金峪 王詩晨 李金澤 黃 瑜 黃志堅 殷光文*

(1.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福州，350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福州，350002；3.福建省畜牧獸醫研究所，福州，350013)

黑水雞(Gallinulachloropus)通體黑褐色，嘴黃色，嘴基與額甲紅色，兩脅具寬闊的白色縱紋，尾下覆羽兩側為白色，中間黑色，腳黃綠色，腳上部有一鮮紅色環帶[1]，是具有重要科研、觀賞和經濟開發價值的涉禽。黑水雞的人工繁育工作在我國部分地區已經嘗試開展，研究其寄生蟲寄生和感染情況，對保護和開發黑水雞資源具有重要意義。

棘口吸蟲(Echinostomaspp.)是一類寄生于水禽體內的常見消化道吸蟲。生活發育過程經歷卵、毛蚴、胞蚴、母雷蚴、子雷蚴和囊蚴等階段，淡水螺、蛙和淡水魚等均是其重要的中間宿主，主要致病機理為棘口吸蟲的吸附結構刺激禽類腸道黏膜，導致禽類患腸炎，營養被剝奪，同時由于其分泌毒素，容易造成禽類消化機能發生障礙，使禽類生長發育受阻等[1]。分子生物學技術在寄生蟲種類鑒定中的應用越來越廣泛，COXⅠ、18S rRNA等也被更多地運用在寄生蟲的分子鑒定中。核糖體間隔轉錄區ITS在絳蟲、線蟲和吸蟲等多類蠕蟲的遺傳研究中應用較廣，被學者認為是一種較好的基因分子標記。

本研究對福建省某地送檢的1例自然死亡黑水雞進行吸蟲完全剖檢法檢測，結合傳統寄生蟲檢測和病理學研究等，通過分子生物技術鑒定分離獲得的蟲株，旨在為黑水雞人工繁育馴化中寄生蟲病的防控提供相關參考。

1 病例簡介

福建省某地送檢的自然死亡黑水雞，雄性，2019年11月送檢時體表毛色暗淡，泄殖腔附近有大量排泄物粘附于肛周羽毛，形體輕度消瘦，口腔黏膜輕度發白，無異常分泌物(圖1)，懷疑患消化道寄生蟲病。

圖1 黑水雞尸體外觀Fig.1 The appearance of the dead Gallinula chloropus

2 材料與方法

臨床解剖，觀察內臟器官有無病理變化。采集有臨床病變的主要部位，浸泡于10%福爾馬林溶液，送往北京康佳宏原生物科技有限公司進行病理組織學切片的制備與觀察。采集蟲體，-20 ℃保存于75%乙醇溶液內，用于分子生物學鑒定。在形態學研究基礎上，采集1株(HSX-01)形態較為完整的腸道內吸蟲進行DNA提取，根據文獻[2]合成吸蟲通用引物進行ITS遺傳區域的擴增。反應體系為25.0 μL(TaqMix酶12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，目的基因DNA模板4.0 μL)。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。獲得陽性條帶切膠回收后送往福州鉑尚生物公司測序。

下載NCBI中與HSX-01株具有較高同源性的吸蟲序列，構建相關吸蟲進化樹。系統進化樹構建方法采用鄰近樹法，循環計算1 000次進行樹圖的制備。使用肝片吸蟲(Fasciolagigantica，MK321642.1)作外群，序列比對方法采用多序列比對分析。

3 結果與分析

3.1 尸體剖檢

臨床解剖死亡黑水雞，發現主要臟器無明顯病變，肝臟輕微充血腫大，腸道部位發黑栓塞，輕度鼓氣，胃腸道內有大量吸蟲蟲體。參照李國清[3]對吸蟲病的確診標準，結合臨床消化道病變，初步判斷感染了棘口吸蟲(圖2)。

圖2 黑水雞腸道吸蟲蟲體(↑示蟲體)Fig.2 The fluke(↑) observed in intestinal autopsy

3.2 蟲體形態學觀察

從消化道中分離出多條形態完整和肉眼可見的吸蟲蟲體(圖3A)。蟲體扁平，長為0.65～1.20 cm，具有多個吸盤，頭部膨大為冠狀結構(圖3B)。腸道內蟲體寄生部位的腸壁變薄，有出血點。

通過臨床光學顯微鏡觀察，吸蟲的尾部無小棘(圖3C)，頭冠上有頭棘(圖3D黑色箭頭)，頸部狹長，腹部具有吸盤結構，腸道纖細，形態學特征符合棘口吸蟲的形態結構[3]。

圖3 黑水雞腸道吸蟲的形態Fig.3 Morphology of intestinal fluke in Gallinula chloropus

3.3 病理組織觀察

由蘇木精與伊紅染色制備病理HE石蠟切片觀察可知，黑水雞腸黏膜層局部壞死，絨毛結構消失，伴有大量壞死細胞碎片(圖4A)；心臟組織局部心肌纖維斷裂，纖維溶解伴有炎性細胞彌散性浸潤(圖4B)；炎性細胞灶性浸潤，肝血竇擴張充血(圖4C)；部分小腸絨毛上皮細胞脫落壞死，炎性細胞彌散性浸潤(圖4D)。

圖4 黑水雞病理組織檢查結果(200×，HE)Fig.4 Histological examination results of Gallinula chloropus(200×，HE)

3.4 分子生物學鑒定

黑水雞吸蟲ITS擴增片段大小為744 bp(圖5)。使用DNAStar 7.0生物分子軟件，參照NCBI中已報道的吸蟲序列進行PCR產物擴增區域劃分，結果顯示：同源性登錄序列從高至低依次為Echinostomatrivolvis(GQ463127.1)，E.friedi(AJ564383.1)和E.cap-roni(AJ564382.1)，同源性分別為92.87%、92.73%和92.60%。比較BD引物擴增的ITS區域片段，分析該片段的ITS2遺傳信息，使用DNAStar 7.0軟件，比較獲得的ITS序列與E.trivolvis(GQ463127.1)，發現擴增獲得的序列相對保守，同源性均超過90.00%。

圖5 樣品ITS遺傳區域PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification results of the ITS genetic region of the sample 注：M.Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1.吸蟲HSX-01的ITS擴增產物 Note：M，Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker.1，The ITS amplified products of fluke HSX-01

借助生物分析軟件構建進化樹，發現黑水雞腸道寄生的棘口吸蟲(HSX-01)在生物分子遺傳上更接近于E.trivolvis(GQ463127.1)，同源性達92.90%，此外，與其他棘口吸蟲(AJ564383.1、CQ463132.1、KM520150.1、AF336232.1、GQ463127.1、AJ564382.1和MT409012.1)也具有較高的同源性，同源性均大于91.00%。通過同源性比對、樣本株與進化樹分析，本次分離獲得HSX-01株吸蟲與棘口吸蟲(AJ56-4383.1、GQ463132.1、KM520150.1、AF336232.1、GQ463127.1、AJ564382.1和MT409012.1)在樹圖上形成單獨的區域分支，與外屬吸蟲——肝片吸蟲(MK321642.1.1)存在較遠的樹圖遺傳距離(圖6)。

圖6 黑水雞棘口吸蟲ITS Neighbor-joining進化樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed by the sequences of ITS of Echinostoma spp.

4 討論

王麗坤等[4]曾報道丹頂鶴(Grusjaponensis)感染棘口吸蟲的案例；趙國等[5]報道了白腹秧雞(Amaurornisphoenicurus)感染棘口吸蟲，對病理組織學形態觀察研究；我國南北方城市均有關于雞[6]、鴨[7]、鵝[8]，甚至野生哺乳動物如海獅(Zalophuscalifornianus)[9]等感染棘口吸蟲的報道，可見該類吸蟲感染的范圍較廣，存在跨宿主寄生的可能性。

黑水雞作為一種常見的涉禽，主要生活在鄉村水塘、沼澤和灘涂地，主要食物為湖泊和沼澤生態系統中的魚、蝦和螺等小型水生動物及水生植物，棘口吸蟲常寄生于水生動物體內，這也成為黑水雞感染該病的重要食源性途徑。筆者對黑水雞的死亡原因進行分析，發現并確診其為棘口吸蟲感染，通過病理組織學切片研究其消化道病變，發現死亡黑水雞腸道表現為炎性灶遷移浸潤，腸道黏膜壞死，腸道絨毛層結構出現不同程度損壞，伴隨肝炎、淤血和心肌撕裂等病變，可能與寄生吸蟲破壞腸道結構有關。我國對黑水雞消化道吸蟲的報道主要停留在形態學方面，分子遺傳鑒定較少，本研究通過對ITS遺傳區間測序和構建進化樹，為黑水雞消化道吸蟲的種類鑒定提供了重要參考。

徐光輝等[10]報道了棘口吸蟲感染會引起發燒及肝功能異常的臨床癥狀。在本案例中，被感染的黑水雞除了消化系統出現炎癥外，心和肝等部位也存在不同程度的炎性病理組織學變化，可能由于棘口吸蟲感染直接或間接引發細菌等微生物感染所致。本案例首次通過分子生物學技術對黑水雞棘口吸蟲的種群遺傳學進行深入研究，為黑水雞野生種群棘口吸蟲病的臨床診斷提供了依據。