花生乳組成對姜黃素生物利用率的影響

余 聰，方曉峰，彭盛峰

(1．江西省藥品檢查員中心，330029，南昌；2．食品科學與技術國家重點實驗室，330047，南昌)

0 引言

黃素(Curcumin)是姜黃和其他植物根莖中發現的一種親脂性的多酚類物質，也是姜黃中最具生物活性的成分。大量研究表明，其具有抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應小[1-7]。姜黃素在世界范圍內得到多種不同形式的認可和使用，如印度，含有姜黃素的姜黃被用于咖喱中；在泰國，它用于化妝品；在中國，它被用作著色劑；在美國，除了膠囊劑和粉末劑外，它還用于芥末醬、奶酪、黃油和薯片中，作為防腐劑和著色劑。姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，但單獨攝入姜黃素不會帶來相關的健康益處，這主要是由于吸收不良、新陳代謝與消除迅速所致，且其在水中的溶解性也極差，這些缺點極大地限制了其在食品、化妝品和醫藥等行業的應用與發展[8]。

植物乳是用含蛋白質和脂肪的植物種子(如大豆、核桃、花生等)或果實(如椰子等)鮮榨后得到的制品，其中存在植物油體和多種植物蛋白。油體(oil body)是子葉細胞內甘油三酯的儲存形式，其核心由疏水性甘油三酯構成，周圍包裹著一層磷脂，其中嵌入了各種兩親性的蛋白。油體蛋白通過在油體的疏水成分和親水細胞質之間形成一個界面來穩定油體，其所提供的靜電斥力和電阻滯力對油體的完整性和穩定性起著關鍵作用[9-10]。因此，油體存在的疏水核心和穩定的結構使其極為適合作為包埋姜黃素的天然載體。植物乳中還存在有多種天然的植物蛋白，可作為天然的乳化劑對姜黃素進行包埋。然而目前關于植物乳中單獨組分對姜黃素的包埋研究較少，且對負載姜黃素后的產品的消化特性也尚不清晰。

因此，本研究以花生乳為研究對象，分離得到花生粗、精油體、全脂乳和脫脂乳，測定不同產物的油水含量。采用pH驅動的方法，對姜黃素進行溶解包埋，測定其粒徑與電位，并通過體外消化模型對其在體外消化過程中消化特性進行研究。本研究的結果有助于更有效的姜黃素營養保健品的設計和開發。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

花生(山東谷悅食品有限公司)；姜黃素(C400222)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛膽鹽、口腔粘膜蛋白(M2378)、胃蛋白酶(P7125；酶活力≥400 U/mg)、胰酶(P1750；4×USP specifications)、脂肪酶(L3126；酶活力 100～400 U/mg)均購買于中國上海Sigma Aldrich 公司；氫氧化鈉標準滴定液等試劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司。

1.2 實驗儀器

MasterSizer 3000微米粒度儀(英國Malvern公司)；UV-1600PC紫外分光光度計(上海美譜達公司)； SHJ-4A水浴鍋(江蘇東鵬儀器制造有限公司)；907 Titrando pH-stat自動電位滴定儀(瑞士萬通中國有限公司)；共焦掃描激光顯微鏡(尼康D-Eclipse C1 80i，梅爾維爾)。

1.3 油體的提取、純化與樣品制備

根據Tzen等[11]的方法對花生油體進行提取與純化，并進行了以下改進。將200 g花生在pH為8.0的磷酸緩沖液(PBS)中按1:7 (w/w)的比例在4 ℃下浸泡16 h，然后丟棄浸泡培養基[12]。以1:7 (w/w)的比例在破壁機中破碎90 s。研磨后的漿液用3層紗布過濾。濾液轉移至400 mL管中，在4 ℃下以1 000 g離心30 min。上層用抹刀分離，在濾紙上瀝干(Whatman, 5級)，稱為粗油體。將制備的粗油體分散于pH為8.0的PBS中，1:7(w/w)，離心10 000 g，30 min。重復上述操作3次，離心后取面霜層，所得物稱之為精油體。破壁之后經3層濾布所得漿液稱之為全脂乳，離心后中間層稱之為脫脂乳。所有樣品保存于4 ℃下，24 h內完成分析。

1.4 油含量的測定

采用索氏提取法進行油含量測定。稱取2～10 g 樣品于蒸發皿中，加入約20 g海沙，于沸水浴上干燥，再于105 ℃下烘干，研細，轉移至濾紙筒中。搭好索氏提取裝置，將濾紙筒放入抽提管中，加入石油醚至2/3處。在60 ℃恒溫水浴抽提10 h。抽提回流結束后，回收石油醚，將收集瓶置于105 ℃下烘干至恒重，冷卻后稱量。

油含量(%)=(收集瓶與樣品所含脂肪質量-抽提瓶質量)/樣品質量× 100%

1.5 水分測定

取潔凈鋁制扁形稱量瓶2個，置于105 ℃干燥箱中，瓶蓋斜蓋于瓶口，加熱1 h，取出蓋好，置于干燥器內冷卻0.5 h，稱量，重復干燥至恒量m1。稱取2份2 g樣品，分別放入2個稱量瓶中(以下以“瓶1”“瓶2”標號)，樣品厚度約5 mm。加蓋，精密稱量m2后，至105 ℃干燥箱中，瓶蓋斜蓋于瓶口，干燥4 h后，蓋好取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱量。然后再放入105 ℃干燥箱中干燥1 h左右，取出，放干燥器內冷卻0.5 h后再稱量m3。至前后2次稱量差不超過2 mg，即為恒量。水分含量由公式(1)計算：

(1)

1.6 pH驅動法載入姜黃素

將稱取的姜黃粉末完全溶解于的氫氧化鈉溶液(0.1 N NaOH)中，制備出10 mg/g的姜黃素原液。然后將堿性姜黃素原液加入到花生粗、精油體、全脂乳和脫脂乳中(1:10 w/w)，用鹽酸溶液快速調節，最終pH值為6。將添加姜黃素的乳液用雙蒸餾水稀釋，得到含有2%油的最終體系，在室溫下攪拌10 min，以保證均勻性。最后，在體系中加入非食品級防腐劑疊氮化鈉(0.02%)，以抑制微生物的生長。需要注意的是，pH驅動的方法會在最終樣品中形成一些NaCl，因為使用NaOH生成堿性溶液，然后加入HCl中和。根據初始NaOH濃度(0.1 M)和稀釋倍數(1:10)，預計最終樣品的NaCl水平在10 mM左右。

1.7 粒徑

粒徑的大小由商用的靜態光散射儀器在常溫下測定[13]。粒度數據被報告為表面加權平均直徑(d32)，樣品用相對應pH值的去離子水稀釋。

1.8 負載姜黃素的油體及其副產物的體外消化特性

參考André等[14]的方法并作略微修改，利用模擬胃腸道模型開展其體外消化實驗，口腔：將餅干與口腔液(含3 mg/mL粘液素)按1:1比例混合，調節pH至6.8，孵育10 min；胃部：將口腔消化液與胃液(含3.2 mg/mL胃蛋白酶)按1:1比例混合，調節pH至2.5，孵育2 h；小腸：在胃消化食糜(30 mL)中加入腸液、膽鹽，再調節pH至接近7.0，加入脂肪酶，通過pH恒定滴定儀恒定pH至7.0。

游離脂肪酸消化速率：通過pH恒定滴定儀的NaOH滴定量表征其游離脂肪酸消化速率，由公式(2)計算：

FFA%=100×(VNaOH×mNaOH×Mlipid)/2Wliquid

(2)

式中：FFA為游離脂肪酸消化速率；VNaOH是中和脂質分解出的酸所需的滴定液的體積，mNaOH是氫氧化鈉的物質的量濃度，Mlipid是所使用的油的分子量，2表示一個甘油三酯釋放2個游離脂肪酸，Wliquid是消化系統中油脂的質量(g)。

穩定性和生物可接受率：體外消化模型結束后，將腸液以12 000 g離心30 min，收集中間膠束相。提取的含姜黃素溶液用紫外可見分光光度計在420 nm處檢測分析。使用事先準備好的標準曲線確定姜黃素濃度。生物可接受率(B*)與穩定性(S*)測量由公式(3)、(4)計算:

B*=100×CMicelle/CDigesta

(3)

S*=100×CDigesta/CInitial

(4)

式中：CMicelle表示混合膠束層中姜黃素的濃度，CInitial表示在初餅干中姜黃素的濃度，CDigesta表示在總的小腸消化結后消化液中姜黃素的濃度。

1.9 共聚焦(CLSM)

使用共聚焦掃描激光顯微鏡200倍放大(20物鏡10目鏡)對樣品的顯微結構進行表征。以尼羅紅溶液(將尼羅紅溶解于乙醇中，最終濃度為1 mg/mL)的形式加入疏水熒光染料對樣品中的油區進行染色。

1.10 數據處理

每個實驗進行3次，以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS 22分析軟件對數值進行方差分析，通過Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 含油量與含水量

由表1可知，花生粗油體的含油量77.65%，略低于精油體的78.01%，含水量也呈現相似趨勢，粗油體中的含水量為18.13%，略低于精油體的19.23%。這些結果表明，精油體中除油、水外的物質顯著低于粗油體，這可能是由于堿性的PBS在洗滌過程中除去了油體表面的雜蛋白[15]。全脂乳中油含量為4.99%，而脫脂乳中的油含量僅為0.13%。這些結果對體外消化過程中原樣品的初始油含量的標定具有重要意義。

表1 花生油體及其副產物的含油量與含水量

2.2 載入姜黃素的花生油體及其副產品的體外消化特性

2.2.1 油體及其副產品的游離脂肪酸釋放 通過pH驅動的方法使用油體負載姜黃素，以同樣加入姜黃素的全脂乳和脫脂乳為對照，考察姜黃素在不同載體運輸下的體外消化特性。游離脂肪酸釋放結果如圖1所示，粗、精油體的游離脂肪酸釋放結果無顯著性差異，這表明采用堿性PBS對油體進行純化不會影響其游離脂肪酸的釋放。全脂乳中游離脂肪酸釋放速率最快，2 h后FFA值高達91.22%。而脫脂乳由于其油脂含量過低，在前30 min，游離脂肪酸基本完全釋放。

圖1 (a)NaOH的消耗量；(b)FFA釋放曲線

2.2.2 不同載體對姜黃素穩定性與生物可接受率的影響 由圖2可知，脫脂乳中姜黃素的穩定性最好為88.17%，顯著高于精油體(62.46%)、粗油體(64.96%)和全脂乳(73.96%)。精油體中姜黃素的生物可接受率為52.10%，顯著高于粗油體的39.92%。這歸因于純化過程中堿性PBS能夠去除油體中受污染的蛋白質[15]，維持和增強油體界面蛋白膜的完整性和穩定性，緩解其在胃環境下的蛋白水解[16]，從而提高姜黃素的生物可接受率。全脂乳中姜黃素的生物可接受最高為76.31%，這可能與油體的乳化性能有關，油體制備過程中殘留的油體具有較好的乳化能力[17]，加入姜黃素后，能夠形成較為穩定的乳液，從而提升了姜黃素的生物可接受率和穩定性。脫脂乳中姜黃素的生物可接受率僅為28.25%，這可能與姜黃素存在的形態有關，結晶形式的姜黃素生物利用度極低[18]。這些結果表明，花生油體具有包埋和保護姜黃素的能力，通過堿性溶液的純化可進一步提升姜黃素的生物可接受率。

圖2 姜黃素標準曲線

2.2.3 負載姜黃素的不同顆粒在消化過程中的變化 由圖3可知， 不同種負載姜黃素的粒子在各消化階段的粒徑變化趨勢相近，口腔消化過程中，粒子的粒徑無明顯變化，而在腸消化階段發生明顯聚集，粒徑顯著增大，在腸消化末期，粒徑也略有增大。這可能是由于在胃部環境下，油體界面上部分蛋白質發生水解[16]，降低和破壞了油體的穩定性，從而導致粒子發生聚集現象。過酸的胃部環境也會使得姜黃素析出，形成結晶，顆粒增大。使用共聚焦掃描激光顯微鏡對粒子各消化階段的微觀結構進行觀察，結果如圖4所示，在胃消化階段，粒子的粒徑明顯增大，這一結果也印證了粒徑測量結果的準確性，在腸消化階段，粒子進一步聚集，大部分物質被消化。

圖3 不同載體中姜黃素的穩定性和生物可接受率

圖4 消化過程中負載姜黃素的粒子的粒徑變化

圖5 消化過程中粒子的微觀圖像

3 結論

本文制備了花生粗油體、精油體、全脂乳和脫脂乳，測定花生油體及其副產物的油水含量。采用pH驅動的方法，對姜黃素進行溶解包埋，測定其粒徑與電位，并通過體外消化模型對其在體外消化過程中消化特性進行研究。結果表明，堿性PBS的洗滌能夠有效去除油體中受污染的蛋白。負載姜黃素的全脂乳中游離脂肪酸的消化速率最高，2 h后達到91.22%，油體的純化對油體的游離脂肪酸消化速率無明顯影響。負載姜黃素的油體及其副產物在胃消化過程中有明顯聚集。純化后的油體表現出更高的生物可接受率。研究的結果有助于更有效的姜黃素營養保健品的設計和開發。