探針ASPCR檢測肺炎支原體微量耐藥突變A2063G方法的建立

郭東星，胡文娟，李 丹，李靜宜，吳趙永，栗紹剛，田秀君，辛德莉

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, MP）能夠引起肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP）和其他呼吸道感染性疾病[1-3]。大環內酯類抗生素、四環素類抗生素（多西環素及米諾環素等）和氟喹諾酮類藥物是臨床上常用于治療MPP的藥物。其中，氟喹諾酮類藥物是治療成人MPP的主要藥物，由于氟喹諾酮類及四環素類藥物可能對兒童的發育造成一定影響，大環內酯類抗生素成為治療兒童MPP的首選藥物。但伴隨著抗生素的使用，相應的耐藥MP也出現了較大規模的流行，尤其在亞洲地區，MP耐藥率呈增高趨勢[4-5]，給治療相關疾病帶來了極大挑戰。

23S rRNA基因可變區域肽基轉移酶環的點突變可以干擾大環內酯類藥物與rRNA的結合，是MP對大環內酯類抗生素耐藥的主要機制[6-7]。其中，A2063G是最常見的突變，可導致MP對大環內酯類藥物較高水平的耐藥性[4，6，8-11]。前期研究結果表明，在MP感染者體內，耐藥菌株與敏感野生菌株以混合菌群的形式存在[12]，耐藥菌群所占比例與臨床用藥種類、劑量及治療效果密切相關。建立有效的檢測MP菌群中耐藥MP比例的方法，對于制定MPP臨床治療方案和研究MP耐藥發生發展規律具有重要意義。本課題組前期研究發現，MP在感染者體內是以混合菌群的狀態存在，另有病例報道稱，MP感染者體內菌株的藥物敏感性可能隨著治療的進程會發生變化[13]。因此，在MP感染者體內，支原體菌群可能隨著治療藥物的使用和病程的進展發生耐藥變異，并在一定的選擇壓力下，菌群中耐藥菌株和敏感菌株的相對占比也在不斷發生變化。目前臨床中常用的檢測方法僅能夠檢測是否MP感染或是否存在耐藥MP，無法檢測耐藥MP的相應占比。

本課題組前期建立了檢測咽拭子樣本中MP耐藥突變的ASPCR方法[12]。但在之前的研究中，ASPCR方法多為染料法[12，14-15]，在檢測臨床樣本時往往會出現非特異性的擴增，在結果分析時須要結合擴增曲線和熔解曲線進行判讀，對臨床檢測人員的技術要求較高，且會耗費一定時間，一旦出現非特異性擴增就會直接影響耐藥菌株比例計算結果的準確性，進而須要對樣本進行重新檢測。因此，為了克服以上缺陷，我們對前期的染料法ASPCR進行了改進，建立了檢測MP A2063G耐藥突變的探針ASPCR方法，并對該方法的靈敏度、特異度、準確度和檢測臨床樣本的性能進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 咽試子樣本 本研究中用于方法驗證的58份臨床咽拭子樣本采集自2014年民航總醫院兒科門診及住院的臨床診斷為疑似MMP的2～12歲患兒。

1.1.2 菌株 MP標準株M129（ATCC 29342）為本實驗室長期保存菌株，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發酵支原體、假單胞菌、解脲支原體等用于驗證方法特異性的臨床分離菌株，均由首都醫科大學附屬北京友誼醫院檢驗科饋贈。

1.1.3 主要試劑和儀器 基因組提取試劑盒、PCR產物純化及質粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。配制實時定量PCR反應體系用的TaqManTMUniversal Master Mix II和ABI Prism@7500型熒光定量PCR儀均為Thermo Fisher公司產品。

1.2 方法

1.2.1 方法建立 引物/探針組合設計：根據MP23S rRNA基因序列（GenBank, accession No.NR_077056）設計特異性引物/探針組（SP-2063-F，2063D-R和S2P-AS-18）和非特異性引物/探針組[NU-F（Np），2063D-R 和 N2P-AS-16]（表1）。特異性引物/探針組合在一些特定的基因位點以次黃嘌呤核苷酸代替，以提高特異性引物/探針組合的特異性，最終能夠選擇性地擴增含有A2063G突變的DNA模板，用于對耐藥菌株進行定量；而非特異性引物/探針組合能夠擴增所有MP DNA模板，用于對總菌群進行定量。

表1 引物及探針序列及其在M129基因組中的位置信息Table 1 Oligonucleotide sequences and locations on the M129 genome

標準品構建：以M129標準株為模板，擴增全長23S rRNA基因片段，連接至pMD18-T載體中，構建含2063位點的野生型質粒；在野生型質粒基礎上對2063位點進行定點突變，構建突變型質粒，將2種基因型質粒梯度稀釋為10～106拷貝/μl后作為標準品備用。

標準曲線繪制：用特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組分別擴增含A2063G突變型標準品（3復孔，Ct=Ct平均值±標準差），橫坐標為標準品拷貝數的對數值（lg），縱坐標為相應Ct值，分別繪制出定量突變型模板的特異性標準曲線和定量總MP的非特異性標準曲線。

反應體系：TaqManTMUniversal Master Mix II：10 μl，10 μmol/L 的 SP-2063-F/2063D-R 或 NU-F（Np）/2063D-R 引物各 1 μl，探針 S2P-AS-18或S2P-AS-16 0.5 μl，DNA 模板 1.0 μl，ddH2O 6.5 μl，總體積 20.0 μl。

擴增條件：60 ℃ 30 s；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環；60 ℃ 30 s，熒光檢測信號激發基團和淬滅基團分別選為FAM和NFQ-MGB。

1.2.2 方法性能驗證

1.2.2.1 檢測MP特異性驗證 采用非特異性引物/探針組擴增臨床常見感染呼吸道且易與MP發生交叉反應的菌種（大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發酵支原體、假單胞菌、解脲支原體）和M129標準菌株擴增結果進行比較，以驗證新建探針ASPCR方法檢測MP的特異性。

1.2.2.2 檢測MP A2063G耐藥突變特異性驗證 主要從以下2個方面進行驗證：①用特異性引物/探針組分別擴增等量的突變型（2063G）與野生型（2063A）DNA模板，比較2者的Ct值的差值（△Ct），△Ct值的大小代表了特異性引物/探針組區分2種基因型能力的強弱，即△Ct值越大表明該方法檢測A2063G突變的特異度越好；②用特異性引物/探針組測定野生型和突變型混合模板的Ct值，比較其Ct值與特異性引物/探針組擴增對應等量的突變型DNA模板的Ct值，2者一致性越好，說明該方法檢測A2063G耐藥突變的特異度越高。

1.2.2.3 檢測MP靈敏度驗證 用非特異性引物/探針組進行擴增反應， MP DNA模板為10～106拷貝/反應，驗證該方法檢測MP的靈敏度。

1.2.2.4 檢測MP A2063G耐藥突變靈敏度驗證 使用特異性引物/探針組擴增105拷貝野生型模板，共重復3次，定義臨界值=Ct平均值+標準差；使用特異性引物擴增突變比例為0.01%～100%的混合模板，得到相應的Ct值（Ct平均值±標準差）并與臨界值進行比較，小于臨界值說明混合物中存在突變模板，大于臨界值說明突變無法檢出，可檢出最低突變比例即為該方法檢測A2063G耐藥突變的靈敏度。

1.2.2.5 準確度驗證 用非特異性引物/探針組和特異性引物/探針組分別擴增突變模板含量為0.01%～100%的混合DNA，分別根據標準曲線進行定量，計算出混合模板的突變比例（檢測突變比例=特異性擴增模板拷貝數/非特異性擴增模板拷貝數×100%）。比較該方法的檢測突變比例與理論突變比例值，2者一致性越高，則該方法的準確度越高。

1.2.2.6 檢測臨床標本性能驗證 采用新建立的探針ASPCR方法、巢式PCR聯合DNA測序法和前期建立的染料ASPCR方法分別檢測58份臨床咽拭子標本，通過比較該方法與其他2種方法的檢測結果，評價該方法檢測MP感染的性能，通過比較該方法與染料ASPCR方法的檢測結果，驗證該方法檢測野生型和耐藥型MP比例的性能。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件對實驗結果進行統計分析，采用配對t檢驗對新建探針ASPCR與染料ASPCR方法的檢測結果進行統計分析，對ASPCR方法與巢式PCR聯合測序方法的檢測結果進行陽性符合率、陰性符合率、總符合率分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 標準曲線繪制 標準曲線特異性引物/探針組（SP-2063-F，2063D-R和S2P-AS-18）和非特異性引物/探針組[NU-F（Np），2063D-R和N2P-AS-16]分別擴增含A2063G突變型標準品（3復孔，Ct=Ct平均值±標準差），繪制的標準曲線，見圖1。非特異性標準曲線：y=-3.15x+38.95，R2=1.00；特異性標準曲線：y=-3.2044x+38.961，R2=0.999；2條標準曲線幾乎重合，表明新建探針ASPCR方法檢測模板拷貝數與相應Ct值之間具有良好的相關性，能夠應用該標準曲線進行定量。

圖1 擴增A2063G的特異性和非特異性標準曲線◆所在直線為非特異性引物/探針組擴增A2063G突變型標準品得到的非特異性標準曲線；●所在直線為特異性引物/探針組擴增A2063G突變型標準品得到的特異性標準曲線Figure 1 Specific and non-specific standard curves of A2063G

2.2 方法性能驗證

2.2.1 檢測MP特異度驗證 新建探針ASPCR方法檢測用以驗證特異性的菌種，均未出現擴增信號，結果見表2。由此可見，該方法檢測MP具有良好的特異度。

表2 探針ASPCR方法的特異度Table 2 Specificity of the probe ASPCR

2.2.2 檢測MP A2063G耐藥突變特異度驗證 ①用特異性引物/探針組分別擴增105拷貝的突變型（2063G）與野生型（2063A）DNA模板，△Ct值約為10.93（圖2A）；特異性引物/探針組能夠正常擴增104和103拷貝突變型模板（見標準曲線），但擴增104和103拷貝野生型模板時，無擴增信號。②將107拷貝/μl的突變型模板視作突變型比例100%，用106拷貝/μl的野生型質粒梯度稀釋含2063G的突變模板，得到突變比例為50%～0.01%的混合模板，對該混合模板進行檢測，其Ct值仍與相應濃度的純突變型模板具有良好的一致性（圖2B）。說明特異性引物/探針組能夠有效區分突變型和野生型，具有良好的檢測A2063G耐藥突變的特異度。

圖2 探針ASPCR方法特異度驗證A.分別為特異性引物/探針組擴增105拷貝/μl A2063G突變模板和野生型模板的擴增曲線，△Ctab（Ctb- Cta）=10.93；B.◆所在直線為特異性引物/探針組擴增A2063G突變型標準品得到的特異性標準曲線，●所在直線為特異性引物/探針組擴增梯度稀釋的A2063G突變型模板和5×106拷貝/μl野生型模板的混合物DNAFigure 2 Allelic discrimination of the probe ASPCR assay

2.2.3 靈敏度與準確度驗證 用特異性和非特異性引物/探針組分別擴增相應的標準品，所得擴增曲線梯度均勻，靈敏度均達10拷貝（圖3～4）。

圖3 特異性引物/探針組擴增A2063G突變基因的靈敏度特異性引物/探針組擴增A2063G突變型標準品的擴增曲線，從左到右依次為108～101拷貝Figure 3 Sensitivity of the specific primers and probe for testing A2063G

圖4 非特異性引物/探針組擴增目的基因的靈敏度非特異性引物/探針組擴增A2063G突變型標準品的擴增曲線，從左到右依次為108～101拷貝Figure 4 Sensitivity of the non-specific primers and probe

根據計算所得臨界值為33.96；使用特異性引物擴增突變比例為100%～0.01%的混合模板，得到相應的Ct值均＜臨界值（圖5）。用非特異性和特異性引物/探針組同時擴增混合模板，實際檢測突變比例與理論突變比例值具有良好的一致性（圖6），說明探針ASPCR方法檢測MP A2063G耐藥突變具有良好的準確度。另外，當理論突變比例為0.01%時其相應的Ct值仍顯著小于臨界值；當理論突變模板比例為0.1%時，與檢測到的比例具有良好一致性，低于0.1%時，測得值將顯著偏離理論值，因此結合靈敏度和準確度的驗證結果，最終確定探針ASPCR方法檢測MP耐藥位點的靈敏度可達0.1%。

圖5 探針ASPCR方法檢測A2063G靈敏度圖中直線為特異性引物/探針組擴增105拷貝/μl野生型模板得到的臨界值；●為特異性引物/探針組擴增A2063G突變模板比例為100%～0.01%的混合物所得Ct值Figure 5 Sensitivity of the probe ASPCR assay

圖6 探針ASPCR方法檢測A2063G準確度橫坐標軸為A2063G突變模板理論比例，縱坐標軸為0.01%～100%的混合模板的檢測比例Figure 6 Accuracy of of the probe ASPCR assay

2.2.4 臨床標本檢測應用 使用新建探針ASPCR方法、染料ASPCR方法和巢式PCR聯合DNA測序法分別檢測58份臨床咽拭子標本。探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測MP感染陰、陽性結果一致，總陽性率相同，均為94.83%（55/58）；巢式PCR聯合DNA測序法檢測MP陽性率為75.86%（44/58），ASPCR和巣式PCR方法同時檢測為陽性樣本44份，同為陰性3份，陽性符合率是80.00%，陰性符合率是100%、總符合率是81.00%。其中探針法和染料法2種ASPCR方法檢測結果中野生型、A2063G突變型和混合菌群的樣本數量分別為20/16（＜S%）、10/14（100%）、20/21（≥20%，＜100%）（見表3）。配對數據t檢驗結果顯示，t=2.057 ，P=0.044，說明染料ASPCR方法檢測的A2063G耐藥突變比例顯著高于探針ASPCR方法檢測的結果。探針ASPCR方法檢測臨床樣本的擴增結果見圖7～9。

表3 探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測A2063G結果比較（例）Table 3 Comparison of the results of dye-ASPCR and probe-ASPCR for testing A2063G (cases)

圖7 混合基因型臨床樣本檢測結果探針ASPCR方法檢測混合（野生型+A2063G）臨床樣本的擴增曲線：a.是用非特異性引物擴增的擴增曲線；b.是A2063G特異性引物擴增的擴增曲線圖，說明樣本中肺炎支原體是混合菌群，同時含有野生型和耐藥突變型Figure 7 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mixed genotype

圖8 野生型基因型臨床樣本檢測結果探針ASPCR方法檢測野生型臨床樣本的擴增曲線：a.是用非特異性引物擴增的擴增曲線；b.是A2063G特異性引物擴增反應結果（未發生擴增反應），說明樣本中肺炎支原體均為敏感型，無耐藥突變Figure 8 Results of probe ASPCR testing clinical sample with wild genotype

圖9 突變基因型臨床樣本檢測結果探針ASPCR方法檢測突變型臨床樣本的擴增曲線，特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組擴增樣本的曲線完全重合，說明樣本中肺炎支原體耐藥比例為100%Figure 9 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mutant genotype

3 討 論

位于23S rRNA V區域的A2063G和A2064G點突變能夠干擾大環內酯類藥物與MP rRNA的結合，是MP耐藥發生的主要機制[15-16]。其中，A2063G突變是耐藥MP的最主要突變類型[17-18]。本研究建立了具有高靈敏度的探針ASPCR方法，能夠準確檢測微量A2063G耐藥突變。采用該方法能夠研究MP感染者體內的不同時期的23S rRNA變異情況，動態監測MP藥物敏感性的變化情況，是進一步研究大環內酯類藥物耐藥發生發展機制的有利工具，并能夠為臨床治療方案的制定提供有效依據。

探針ASPCR方法建立的難點在于特異性引物和相應探針組合的設計，要求該引物探針組合能夠特異性地擴增突變樣本，就需要盡量降低其擴增野生型模板的效率但其擴增突變型模板的效率不能有明顯影響。理論上，當引物3’末端堿基與模板堿基不完全匹配時，其擴增反應效率則會大幅降低，甚至無法擴增，但在研究過程中我們發現，特異性引物序列當中僅末端堿基不匹配時，在模板足量的情況下，野生型模板仍能夠有較高程度的擴增。為此，除了末端堿基外，我們在特異性引物的其他位置也設計了數個不完全匹配堿基（次黃嘌呤），以提高特異性引物對突變型和野生型模板的區分能力。次黃嘌呤的位置及數量對引物的特異性影響很大，須反復進行實驗驗證。另外，研究過程中我們發現，在特異性引物/探針組合中，除了特異性引物外，探針的序列對組合的特異性也有一定影響。在本研究中，對18組引物/探針組合進行了實驗篩選，最終選定表1中所列出的特異性引物/探針組合。

本研究中的探針ASPCR方法是在前期建立的染料ASPCR方法的基礎上重新設計引物/探針組合建立的一種新的ASPCR方法。對2種方法進行比較發現：①2者判讀結果的方法存在差異。探針ASPCR方法在能夠根據擴增曲線直接讀取結果，而染料ASPCR方法對多種上呼吸道感染常見病原體均出現擴增反應，需要同時結合擴增曲線（Ct值）和熔解曲線（Tm值）對檢測結果進行判讀。②2種ASPCR方法檢測臨床樣本的能力不同。臨床樣本檢測結果中常有耐藥菌和敏感菌混合存在的情況，采用染料ASPCR方法常會發生非特異性擴增的情況，此時其Ct值會小于其真實值，最終導致計算出的MP耐藥比例存在一定誤差，這也是導致2種ASPCR方法檢測臨床樣本時，染料ASPCR方法檢測臨床樣本的耐藥比例高于探針ASPCR方法檢測結果（表3）的主要原因，甚至當熔解曲線出現雙峰時，還需要對樣本進行復查。因此，該方法檢測臨床樣本的特異性相對探針ASPCR方法較低，對實驗者的要求也較高。而本研究中新建立的探針ASPCR方法，因其加入了探針，提高了擴增的特異性，可以根據Ct值即可直接判讀結果，符合臨床檢驗工作人員的判讀習慣。

本研究將2種ASPCR方法檢測臨床樣本的結果與巢式PCR聯合DNA測序法的結果進行了比較：ASPCR方法法檢測MP的陽性率高于傳統巢式PCR方法。巢式PCR聯合DNA測序法一般只能檢測出主要基因型，不能檢測出混合株中的其他微量基因型，在這方面，ASPCR方法檢測臨床標本檢測能力明顯優于傳統巢式PCR聯合DNA測序法。另外，本研究中，探針ASPCR方法檢測臨床樣本結果顯示，在近一半[45.45%（25/55）]的感染者體內，MP以敏感菌和耐藥菌混合菌群的形式存在，且在MP陽性樣本中，耐藥菌和敏感菌都可能以優勢菌種的形式存在。這說明，在臨床用藥前，很有必要采用ASPCR方法對臨床樣本進行檢測，分析其中耐藥菌和敏感菌的組成比例及其優勢種群，為臨床用藥選擇提供實驗室依據。