大麻遺傳標記的法醫學應用研究進展

夏若成，陶瑞旸，林 源，張曉春，楊 琪，2，于 歡，2，席世涵，3，熊 磊，4，李成濤，張素華

（1.司法鑒定科學研究院上海市法醫學重點實驗室上海市司法鑒定專業技術服務平臺 司法部司法鑒定重點實驗室，上海200063；2.蘇州大學醫學部法醫學系，江蘇蘇州215123；3.內蒙古民族大學臨床醫學院，內蒙古通遼028000；4.內蒙古醫科大學 法醫學教研室，內蒙古 呼和浩特010030）

大 麻 （Cannabis sativa L.） 是 大 麻 科 （Cannabinaceae）大麻屬（Cannabis）一年生雌雄異株的草本植物，偶有雌雄同株，主要分布于加拿大、意大利、印度以及我國的云南、新疆、黑龍江等地區。 大麻是一種多用途、多功能作物，其纖維是良好的紡織和造紙原料，植株內含有的多種化學成分被廣泛應用于醫藥衛生領域， 種子中富含人體易吸收的蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸與微量元素等多種營養成分，已成為許多國家重要的經濟作物。 然而，大麻的花和葉中含有四氫大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）這一具有強烈成癮性和麻醉性的致幻成分，已被聯合國禁毒公約列為與海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。

大麻的毒性成分主要為THC，研究資料顯示：當人類攝入THC 質量分數低于3 g·kg的大麻，不顯示精神活性；只有攝入THC 質量分數高于3 g·kg的大麻，才具有一定的濫用傾向。 鑒于不同品種的大麻 THC 質量分數差別較大（0.1～200 g·kg），許多國家為防止大麻濫用，按植株內所含THC 含量并結合植株特征和用途，將大麻分為工業大麻/纖維大麻（THC＜ 3 g·kg）、中間型大麻（3 g·kg＜ THC＜5 g·kg）和毒品大麻/藥用大麻（THC ＞ 5 g·kg）3種類型。 我國于2002 年在《云南省工業大麻管理暫行規定》中首次提出了工業大麻的概念，并將工業大麻稱為漢麻或火麻，規定其THC 質量分數低于0.3 g·kg。 大麻是一種二倍體植物，共含有 20 條染色體（18 條常染色體和2 條性染色體），其雌株染色體為 XX 型，雄株染色體為 XY 型。 研究顯示：大麻雌雄植株的利用價值并不相同，雄株的纖維質量明顯高于雌株，但雄性植株中不含THC 或含量較低，雌性植株內THC 含量則相對較高，因此雌株具有藥用價值和濫用可能。

目前，大麻是全球范圍內種植、生產、販賣和吸食最為廣泛的毒品，也是國際社會普遍嚴禁的管制對象。 《中華人民共和國刑法》和《中華人民共和國禁毒法》也明確將大麻列為管制毒品，并采取嚴厲措施打擊涉及大麻的違法犯罪行為。 然而，近年來受到國際上部分國家和地區（如烏拉圭、加拿大和美國阿拉斯加、科羅拉多、華盛頓等州）大麻合法化的影響，我國吸食和濫用大麻人數持續上升，境外走私案件也日益增多。因此，為打擊毒品犯罪，對大麻進行快速、準確的司法鑒定已成為迫切的社會需求。 目前，常規的大麻鑒定方法主要是基于形態學和化學成分的分析。 但在實際案件中，大麻經過加工或與煙葉等混在一起，導致其在形態上無法識別。 對于大麻化學成分的分析，大多采用氣相色譜-質譜聯用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）對生物檢材中的THC 進行定性和定量分析，但利用該方法分析大麻化學成分時，存在所需樣本量較大且對檢材質量要求較高，以及THC 在陳舊樣本中易被氧化等局限性。此外，THC 的含量亦受大麻植株的年齡、性別和種植環境等因素影響，因而影響其化學分析的準確性。

隨著分子生物學技術的快速發展，在DNA 水平上對物種進行鑒定已成為研究的熱點。 鑒于常規的檢測技術不能滿足一些案件中大麻檢材的鑒定需求， 法庭科學家嘗試將DNA 遺傳標記技術運用到大麻的鑒定中，并取得較為理想的效果。 本文針對近年來大麻遺傳學的相關研究進行綜述，旨在為司法鑒定和法庭科學中大麻的種屬鑒定、個體識別及來源地推斷的應用提供理論依據。

1 大麻DNA 遺傳標記及其應用

1.1 序列特異性擴增區

大麻雌、雄植株的利用價值并不相同，只有雌性植株存在濫用傾向。 然而，陳舊的大麻樣本、經過加工的大麻樣本以及花期之前的大麻樣本都無法從形態上準確判斷其性別。 因此，利用遺傳標記技術檢測大麻性別對于大麻育種以及打擊毒品犯罪均具有重要的意義。

序列特異性擴增區（Sequence-Characterized Amplified Region，SCAR）標記因其特異性高、重復性好等優點而被廣泛應用于大麻性別研究。 SCAR遺傳標記是在隨機擴增多態性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA， RAPD）和擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）標記的基礎上衍生而得，兼具RAPD 和AFLP標記的優點。 新的SCAR 引物通常是在原有10 個堿基標記引物的基礎上延長了目標基因組DNA 末端序列的14 個堿基構成，該過程不僅加強了與模板DNA 的特異性結合，還提高了退火溫度以及轉化后新標記的專一性。 MANDOLINO 等發現由隨機引物OPA8 擴增產生的長度為400 bp 的RAPD序列與大麻雄性表型相關，并將此性別特異性RAPD標記轉化為長度為 390 bp 的 SCAR 標記。 T?RJéK等利用20 條RAPD 引物分別對雌雄同株和雌雄異株大麻進行性別特異性遺傳標記的篩選，發現引物OPD05 和引物UBC354 在雄性植株中產生了特異性條帶，并將這兩個雄性特異性RAPD 標記轉化為SCAR 標記，命名為 SCAR323 和SCAR119。 TECHEN等根據MANDOLINO 等人的研究，使用一對與大麻雄性相關的引物MADC2 擴增大麻基因組DNA，在雌性和雄性植株中分別得到約450 bp 和約300 bp的片段，且DNA 分析結果與大麻雌雄植株外觀形態學結果一致。這項研究結果表明，SCAR 遺傳標記技術可作為大麻植株早期發育階段的性別鑒定技術。

SCAR 遺傳標記技術應用于大麻的性別研究在國內也有所開展。陳其軍等用30 對隨機引物對雌雄異株大麻——“云麻一號”進行擴增，得到一條約2.5 kb 的雄性特異性片段，并根據測序結果將其轉化為重復性和特異性更好的SCAR 標記。 李仕金等以“云麻一號”為實驗材料，利用200 條RAPD隨機引物進行大麻性別相關位點的篩選，結果顯示，引物S208 擴增得到一條大小為429 bp 且與大麻雄性相關的特異性條帶。 根據測序結果合成了2條SCAR 標記引物，該SCAR 標記可對已知性別花期和未知性別幼苗期的大麻植株進行準確的性別鑒定。 張貴芹 等使用 T?RJéK 等人開發的SCAR 標記引物，對我國4 個不同地區的120 株已知性別的大麻樣本進行特異性檢測并隨機抽取樣本進行盲測研究。 結果顯示：120 株已知性別的大麻樣本中有113 株樣本檢測結果正確，準確率為94.2%；16 株盲測樣本中有15 株樣本檢測結果正確，準確率為93.8%。

上述研究表明，SCAR 標記可作為大麻性別鑒定可靠而穩定的遺傳標記，但已轉化的SCAR 標記并非都能成功用于大麻性別的鑒定，其準確性仍需進一步驗證。 此外，由于大麻品種多達150 余種，已開發的SCAR 性別連鎖標記是否具有廣泛的適用性還需進一步驗證。 由于在研究已開發的大麻SCAR 遺傳標記中并未發現雌性特異性引物， 因此有必要進一步開發雌性特異性標記，以提高大麻性別鑒定的準確性。

1.2 DNA 條形碼

DNA 條形碼是由加拿大動物學家HEBERT等于2003 年首次提出，是指通過一段短而標準的DNA 片段作為遺傳標記來實現快速、準確、自動化的物種鑒定。 與傳統的依賴形態學進行物種鑒定的方法相比，DNA 條形碼不受鑒定對象的環境、發育階段以及人為等因素的影響，且對鑒定人員的專業知識要求不高，一經提出就被廣泛應用于動物、植物以及微生物領域的物種鑒定。 2009 年，生命條形碼聯盟（the Consortium for the Barcode of Life，CBOL）植物工作組推薦將葉綠體DNA（chloroplast DNA,cpDNA）片段成熟酶 K（maturase K, matK）和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,rbcL）作為鑒定陸生植物的通用條形碼。 然后，又將葉綠體間隔區psbA-trnH 和核糖體DNA 的內轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，ITS）作為植物的補充條形碼。

DNA 條形碼技術已廣泛應用于各個領域的物種鑒定，MELLO 等利用 rbcL 序列引物對 24 例產自巴西的毒品大麻樣本進行PCR 擴增并測序，結果顯示，24 例大麻樣本具有相同的rbcL 序列，且將該序列在NCBI 上進行BLAST 相似性檢索，發現測序所得序列與數據庫中大麻的rbcL 序列相似性高于99%，因而可確認其為大麻。 該研究結果表明，rbcL序列可作為鑒定毒品原植物大麻的DNA 條形碼，且該序列能將產自巴西的大麻樣本與產自中國、美國和英國的樣本相區分。ROMAN 等根據GenBank數據庫中大麻cpDNA 全基因組序列篩選出2 個熱點區域rp132-trnL 和trnS-trnG，并對5 個不同組別（美國纖維大麻、加拿大纖維大麻、美國-墨西哥毒品大麻、智利毒品大麻、智利醫用大麻）的大麻樣本進行遺傳多態性分析，盡管超過80%的樣本具有相同的序列，但在5 個樣本組之間仍然觀察到特異性差異，這表明rp132-trnL 和trnS-trnG 標記在確定大麻樣本來源及樣本類型方面具有一定的作用。

國內應用DNA 條形碼技術主要是對大麻及其混偽品進行鑒別，宋炳軻等利用psbA-trnH 和ITS2 序列對產自5 個不同地區的大麻樣本及其混偽品進行鑒別。 ITS2 序列分析顯示：不同地區的大麻ITS2 序列完全一致，未發現變異位點，且通過BLAST 檢索可鑒定為大麻；psbA-trnH 序列分析結果表明，該序列不但可鑒別不同地域來源的大麻，還可分辨出大麻的性別并區分野生型與栽培型。 代勇等對采自云南的工業大麻和新疆的毒品大麻進行ITS 全序列分析，通過序列比對顯示：新疆大麻與云南大麻ITS 序列具有22 個變異位點，從構建的系統發育樹可看出，新疆毒品大麻與云南工業大麻親緣關系較遠。 該研究結果表明，基于ITS 全序列分析能夠準確地區分出毒品大麻與工業大麻。

DNA 條形碼技術的應用主要是快速準確地進行物種鑒定，上述研究均表明DNA 條形碼可作為鑒定大麻的遺傳標記，且對于確定大麻來源及樣本類型方面也具有一定的作用。 我國對于DNA 條形碼的研究起步相對較晚，且對于大麻的鑒定研究也不夠深入。 為了獲得更多的遺傳信息，CBOL 植物工作組提出需要用多個遺傳標記組合作為植物物種鑒定的標準條形碼。 因此，在今后的研究中，應擴大DNA 條形碼在物種中的應用范圍，開發更多的條形碼序列，以建立一個屬于我國生物物種的條形碼數據庫，這對于物種鑒定以及保護我國物種多樣性方面均具有重要的意義。

1.3 短串聯重復序列

短串聯重復序列（Short Tandem Repeats，STR）也稱微衛星DNA（Microsatellite DNA）或簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），是由 2～6 bp的核心序列串聯組成的寡核苷酸序列，因其具有高靈敏度、高鑒別能力、高種屬特異性、高準確性以及易于標準化等優點，而被廣泛應用于司法鑒定領域的個體識別、親緣鑒定和群體調查，并成為法庭科學領域中應用最為廣泛的遺傳標記。 目前， 植物STR 遺傳標記主要用于植物個體識別、 種屬鑒定、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建等多個方面。 李慧峰等利用10 對多態性良好的STR 引物對山東省原產的蘋果資源進行分析，其中共檢測到139 個等位基因及244 種基因型。 該研究成功構建了山東蘋果種質的分子身份證，為山東省蘋果資源的鑒定工作提供了重要依據。 李元元利用STR 標記構建了包含3 個基因座的罌粟熒光復合擴增檢測體系，并證明該體系能夠將罌粟與其近緣物種及混偽品相區分。

大麻可通過種子種植和克隆繁殖2 種方式進行栽培。 種子種植產生的大麻植株具有其特有的基因型，而克隆產生的植株具有與“母性”個體相同的基因型。在一些特殊案件中，通常既需要對大麻檢材準確鑒別，又需要對大麻樣本進行個體化識別。據此，國內外一些學者嘗試將STR 遺傳標記應用到大麻鑒定中，并證明了其在大麻個體化研究中的潛力。2003 年HSIEH 等報道了第一個大麻STR 基因座CS1，為一個六核苷酸重復序列STR 基因座，該基因座在108 株大麻樣本中的重復單位個數為3～40個，雜合度約為87.04%，這表明基因座CS1 具有高度多態性。在此之后有更多的大麻STR 基因座被開發出來，如 ALGHANIM 等開發了 C11-CANN1、B01-CANN1 和D02-CNAA1 等11 個具有多態性的 STR基因座；VALVERDE 等開發了 5159、4910 和 1528等6 個四核苷酸重復STR 基因座，這也是首次報道的大麻四核苷酸重復STR 基因座。

此外，大麻STR 基因座復合擴增體系的研究也隨之展開。 HOWARD 等根據先前的研究報道，篩選到 ANUCS301、ANUCS302 和 ANUCS303 等 10 個大麻STR 基因座，并成功構建了大麻STR 基因座復合擴增體系，首次根據SWGDAM 驗證指南對該體系進行靈敏度、穩定性以及物種特異性等方面的研究。 VALVERDE 等對 15 個大麻 STR 基因座的不同等位基因進行測序分析，并根據國際法醫遺傳學會 （International Society for Forensic Genetics，ISFG）準則首次提出了大麻STR 基因座的命名方案——基于核心序列重復次數的命名法。 測序結果顯示：D02-CANN1、B05-CANN1、B02-CANN2、E07-CANN1 和ANUCS501 為簡單而穩定的基因座，這也是法醫學中推薦使用的STR 基因座；基因座 H09-CANN2、H11-CANN1 和 ANUCS308 為二核苷酸重復，其表現出高stutter 峰和雜合子不均衡，且基因座ANUCS308 還被報道在33%的樣本中出現丟失現象，因此并不推薦使用這3 個基因座用于大麻STR 復合擴增體系的構建。 HOUSTON 等篩除了上述性能較差的STR 基因座并結合VALVERDE 等開發的6 個四核苷酸重復基因座，成功構建了包含13 個基因座的STR 復合擴增體系，并證明該體系可用于大麻樣品的鑒定分析。

目前，國內對于大麻STR 基因座的研究才剛剛起步，關于大麻復合擴增體系的研究還不夠深入。馬原等選取擴增條件相近、雜合度較高的3 個基因座 ANUCS301、ANUCS305 和 CS1 對大麻進行個體和群體遺傳多態性分析。 結果顯示，所構建的大麻STR 基因座熒光擴增檢測體系具有良好的組織同一性，基因座CS1 和ANUCS305 具有良好的種屬特異性，且CS1 具有高度多態性，ANUCS305 具有中度多態性。該研究為利用STR 遺傳信息推斷毒品原植物大麻的品種和產地提供了理論基礎。

販毒案件中查獲的大麻檢材，多為同一產地或者不同產地的一種或者幾種，如果能對大麻進行準確的種屬鑒定和個體識別，不僅可幫助警方打擊毒品犯罪，還使得不同地區販毒案件的毒源追蹤成為可能。 上述研究表明，STR 基因座復合擴增體系可對大麻進行種屬鑒定、個體識別及來源地推斷。 但目前為止，國內外已開發的大麻STR 基因座較少，僅有33 個，其中法醫遺傳學中常用的四核苷酸重復基因座僅有6 個，且對于大麻STR 基因座復合擴增體系的研究仍處于初級階段，也尚未建立一個全球通用的大麻STR 數據庫。 因此，仍需投入更多的時間、人力和財力去開發符合要求的STR 基因座，這也在一定程度上制約了STR 遺傳標記在大麻研究中的應用和發展。

1.4 單核苷酸多態性

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指基因組中特定部位單個核苷酸變異引起的DNA 序列多態性，被稱為第三代DNA 遺傳標記。 與第一代遺傳標記RFLP 及第二代遺傳標記STR 截然不同，SNP 是單個堿基的轉換和顛倒。SNP 作為目前最具發展潛力的遺傳標記，因具有數量豐富、分布廣泛、突變率低以及易于實現大規模自動化檢測等優點，已被廣泛應用于分子遺傳學、動植物遺傳育種、法醫遺傳學、疾病診斷和治療等眾多應用領域。 劉易科等利用90 K SNP 芯片技術對國內240 個小麥品種進行全基因組掃描，分析其遺傳多樣性。 結果顯示，我國各省市間小麥種質資源交流較為頻繁，但部分品種遺傳相似度較高，因此急需引入新的小麥種質，拓寬遺傳基礎。

目前，通過全基因組測序技術獲得多態性SNP位點已在水稻、小麥、玉米等農作物中廣泛應用，但針對大麻SNP 的研究甚少。ROTHERHAM 等基于四氫大麻酚酸（Tetrahydrocannabinol acid, THCA）合酶基因中399 bp 片段內的4 個多態性位點，運用SNP 技術對94 株大麻樣本（包含10 株未知樣本）進行測序。 結果顯示，該研究開發的SNP 測定法能夠以100%的成功率識別毒品大麻樣本，同時還能區分大麻和其他物種。 SOORNI 等使用簡化基因組的測序方法對98 株大麻樣本進行酶切、測序和分型，結果共檢測到24 710 個高質量的 SNP 位點。 樣本間分析結果顯示，纖維大麻與毒品大麻之間的遺傳差異并不局限于THCA 合酶基因中，而是廣泛分布于整個基因組中。 陳璇等基于全基因組重測序技術對采自中國的野生型和栽培型大麻進行全基因組重測序，并通過與大麻參考基因組（Cansat3_genome）進行比對，共檢測到 2 264 150 個SNP 位點。 該研究結果表明，野生型大麻與栽培型大麻在基因組水平上存在一定的差異，這為野生型和栽培型大麻遺傳分離群體的構建及遺傳標記的開發提供理論基礎。

SNP 作為新一代分子標記，以其數量多、分布廣、遺傳穩定性高以及易于自動化分型等優點，被廣泛應用于多個領域。隨著SNP 分型檢測方法的不斷進步，特別是與DNA 芯片技術相結合，使得檢測的準確性更為可靠。現階段SNP 技術應用于大麻的研究更多的存在于理論方面，但對于其他物種的研究已較為成熟。 因此，未來應用測序技術開發出更多能把不同地區、不同品種的大麻鑒別出來的SNP位點就顯的十分必要，而且利用SNP 所具有的基因定位功能，使得毒源追蹤成為可能。

2 總結與展望

毒品問題仍然是當今世界面臨的重大社會問題之一，無論在中國還是在世界范圍內，該問題都對人類的生存和社會的發展構成了嚴重的威脅。 目前涉及大麻類檢材的鑒定大多采用GC-MS 對生物檢材中的THC 進行定性和定量分析，然而在特殊情況下（如大麻的緝獲量極少、化學分析未檢測到THC、幼苗期大麻、需要分析大麻種子和根等），常規的檢測方法可能會影響鑒定結果的準確性。 此外，在一些大麻犯罪案件中，既需要將案件檢材進行鑒定，又需要對樣本進行個體化分析以推斷毒源，常規的檢測方法無法滿足需求。 大麻遺傳標記的研究彌補了大麻形態學及生化檢測技術的不足，其中SCAR 遺傳標記對于大麻性別的鑒定具有較好的穩定性和特異性，被廣泛應用于大麻性別研究。 盡管對于大麻DNA 條形碼的研究較少，但rbcL 序列、psbA-trnH 序列、ITS2 序列均被證明可作為大麻種屬鑒定的DNA 條形碼，但上述遺傳標記均不能解決大麻個體識別及來源地推斷等問題。 就筆者所知，STR 是目前唯一一個被應用于大麻個體化識別的遺傳標記，然而我國對于大麻STR 基因座復合擴增體系的研究仍處于空白階段。 SNP 作為第三代遺傳標記，可鑒別出不同個體間的遺傳差異，但現階段SNP 技術應用于大麻的研究更多存在于理論。

由于樣本獲取受限，國內外對于大麻DNA 遺傳標記的研究仍較緩慢，我國法庭科學也尚未有對大麻種屬鑒定和個體化識別的DNA 鑒定標準。 因此，大麻遺傳標記的研究尤其是STR 基因座的開發以及復合擴增體系的構建仍需不斷完善，期望隨著大麻STR 數據庫的建立與完善，能夠實現全球大麻信息共享，便于大麻的毒源追蹤，并探索出適用于我國大麻鑒定的DNA 鑒定標準。 此外，隨著對大麻SNP 的深入研究，期望開發出更多能鑒別不同地區、不同品種大麻的SNP 位點，為警方查找毒品來源、鏟除毒品種植基地提供線索。