miR-377在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞增殖、侵襲和EMT的影響

蔣夢亭，施錦梅，葉文蔚，潘 丹

(臺州學院附屬市立醫院 (臺州市立醫院) 婦科，浙江 臺州 318000)

宮頸癌是發生在子宮頸部位的惡性腫瘤，疾病晚期的患者預后較差，且發病機制尚不清楚，因此更好地了解腫瘤進展非常重要。microRNA是一組小的非編碼RNA，通過結合目標基因互補序列的3’非翻譯區負調節基因。研究表明，miRNAs在多種生物過程中如細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發展等過程中發揮著重要作用。miR-377是染色體14q32上的大miRNA簇的成員，在一些人類惡性腫瘤中低表達，包括室管膜瘤、骨肉瘤、胃腸間質瘤和膠質瘤，有文獻報道miR-377通過靶向pim3抑制胰腺癌的增殖。另有研究發現，miR-377過表達可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖、遷移，并促進其凋亡，其機制可能與下調HDAC9、ETS-1蛋白表達有關。但目前關于miR-377與宮頸癌之間的關系尚不明了。本研究擬探究miR-377在宮頸癌中的表達及其作用機制，為進一步深入了解其在宮頸癌中發揮的調控作用而奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 宮頸癌組織、距病變位置約為10 mm的癌旁正常組織，標本來自我院，采集的標本均獲得患者或家屬同意。人宮頸上皮永生化細胞株(H8細胞)、Hela、SiHa、Caski細胞購自上海奧陸生物科技有限公司；DMEM培養基購自中國賽默飛世爾科技公司；PKA通路抑制劑H-89購自美國Selleck公司；E-cadherin、N-cadherin抗體購自上海圣克魯斯生物公司；CUL4A siRNA、miR-377 mimics、miR-377 inhibitor質粒由GenePharma公司合成。本實驗經過本院倫理委員會審查和批準。

1.2 細胞培養與轉染 用DMEM培養基培養宮頸癌細胞Hela、SiHa和Caski細胞、H8細胞，培養基中添加10% FBS，置于37 ℃、5% CO培養箱中，長滿后傳代培養。Hela細胞長滿后分散鋪于12孔板，密度達70%時，添加DMEM培養基，按照說明書將Turbofect、質粒、Opti-MEM混勻后靜置20 min，滴至細胞中，48 h后收集細胞樣用于后續檢測。轉染的細胞分為五組：第一組，包括Control組、mimics NC組和miR-377 mimics組；第二組，包括Control組、inhibitor NC組和miR-377 inhibitor組；第三組，包括CUL4A wt+mimics NC組、CUL4A wt+miR-377mimics組、CUL4A mut+mimics NC組、CUL4A mut+miR-377mimics組；第四組，包括Control組、siRNA NC組和CUL4A siRNA組；第五組，包括Control組、pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-CUL4A組和pcDNA-CUL4A+H-89組。

1.3 細胞增殖測定 Hela細胞分散鋪于96孔板中，細胞密度為75%時用Turbofect試劑轉染重組質粒，48 h后加入100 μL PBS清洗，重復3次，取10 μL CCK-8工作液添加至細胞內，2 h后通過酶標儀讀取細胞在450 nm處的吸光值。

1.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 TargetScan預測miR-377潛在靶基因以及CUL4A wt載體構建成功后，再構建CUL4A mut載體。將Hela細胞接種于12孔板，細胞長到70%～75%時，將CUL4A wt、CUL4A mut分別與miR-377 mimics、mimics NC質粒共轉染至Hela細胞，48 h后測定共轉細胞的熒光素酶活性。

1.5 細胞侵襲實驗 從-20 ℃ 取出matrigel，加入無FBS DMEM培養基進行稀釋(質量濃度為1 mg/mL)，將100 μL matrigel添加于上室中凝成膠狀。調整Hela細胞密度為5×10/mL，細胞懸液添加到Transwell小室，添加DMEM培養基于下室，48 h后加入PBS洗滌小室2次，多聚甲醛固定20 min，再用0.1%結晶紫染色15 min。采用直接法進行計數：隨機選取5個視野細胞放在顯微鏡下觀察，使用正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞，直接計數后進行統計分析。

1.6 細胞劃痕愈合實驗 將轉染的細胞進行消化并制成單細胞懸液，每孔取3×10個/孔細胞置于6孔板中，48 h后取200 μL槍頭在細胞表面垂直于孔板制造線性劃痕，加入PBS清洗細胞，添加空培養基后在顯微鏡下進行觀察和拍照，最后計算細胞劃痕愈合率。

1.7 實時熒光定量PCR 從液氮中取出保存的組織標本，-80 ℃ 取出RNA樣品，加入Trizol，并提取組織和細胞總RNA，RNA濃度和純度測定后，反轉成cDNA，進行實時熒光定量PCR，按照預變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，10 s，退火60 ℃，20 s，延伸72 ℃，30 s，40個循環的程序進行。以GAPDH為內參，使用2法分析結果。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot 提取組織和細胞中總蛋白，BCA試劑盒對蛋白裂解產物進行定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白裂解物，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉在TBST中封閉1 h。PVDF膜與一抗在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，用二抗在37 ℃孵育1 h，最后蛋白顯影及對蛋白條帶灰度值定量分析。

1.9 統計學分析 使用SPSS 19.0統計軟件處理數據。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-檢驗，當<0.05時，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-377在宮頸癌中的表達 如圖1所示，miR-377在宮頸癌組織的表達明顯低于癌旁正常組織，在宮頸癌Hela、SiHa、Caski細胞中的表達明顯低于H8細胞，差異有統計學意義(<0.01)，且在Hela細胞中的表達量最低，因此選取Hela細胞進行后續實驗。

A. miR-377在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達；B. miR-377在Hela、SiHa、Caski和H8細胞中的表達

2.2 過表達miR-377對Hela細胞發展的影響 RT-qPCR結果顯示：miR-377 mimics組的miR-377表達量為2.83±0.57，E-cadherin表達量為0.87±0.21；Control組和mimics NC組的miR-377表達量分別為1.03±0.25、1.12±0.73，E-cadherin表達量分別為0.42±0.06和0.41±0.12；miR-377 mimics組的miR-377、E-cadherin表達量均高于Control組和mimics NC組，差異有統計學意義(<0.01)。如圖2所示，與其他2組比較，miR-377 mimics組細胞侵襲數目明顯減少，N-cadherin表達明顯下降，Hela細胞劃痕愈合率明顯降低，差異有統計學意義(<0.01)。

A.CCK-8檢測過表達miR-377對Hela細胞增殖的影響；B.細胞侵襲實驗檢測過表達miR-377對Hela細胞侵襲的影響；C.Hela細胞侵襲數目；D.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin的表達量；E.E-cadherin、N-cadherin的相對表達量；F.細胞劃痕愈合實驗檢測下調miR-377對Hela細胞遷移的影響；G.Hela細胞的劃痕愈合率

2.3 下調miR-377對Hela細胞發展的影響 RT-qPCR結果顯示，miR-377 inhibitor組miR-377表達量為0.43±0.75，E-cadherin表達量為0.52±0.08；Control和inhibitor NC組miR-377表達量分別為1.12±0.22、1.09±0.27，E-cadherin表達量分別為1.15±0.23和1.06±0.35；miR-377 inhibitor組的miR-377、E-cadherin表達量均低于Control組和inhibitor NC組，差異有統計學意義(<0.01)。由圖3可知，與inhibitor NC或Control組相比，miR-377 inhibitor組細胞增殖能力升高，細胞侵襲數目明顯增加，N-cadherin表達明顯上升，E-cadherin表達明顯下降，Hela細胞劃痕愈合率明顯升高，差異均有統計學意義(<0.01)。

A.CCK-8檢測下調miR-377對Hela細胞增殖的影響；B.細胞侵襲實驗檢測下調miR-377對Hela細胞侵襲的影響；C.Hela細胞的侵襲數目；D.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達量；E.E-cadherin、N-cadherin相對表達量；F.細胞劃痕愈合實驗檢測下調miR-377對Hela細胞遷移的影響；G.Hela細胞的劃痕愈合率

2.4 miR-377與CUL4A的關系 預測miR-377和CUL4A之間的結合位點見圖4A。由圖4B結果可知，和CUL4A wt+mimics NC組相比，CUL4A wt+miR-377mimics組細胞熒光素酶活性降低，差異有統計學意義(<0.01)；2組間細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(>0.05)。由RT-qPCR結果可知：miR-377 mimics組CUL4A表達量(0.37±0.65)低于Control組(1.05±0.46)或mimics NC組(1.14±0.83)，miR-377 inhibitor組CUL4A表達量(2.13±0.42)高于Control組(1.05±0.46)或inhibitor NC組(1.08±0.26)，差異均有統計學意義(<0.01)。

A.TargetScan預測miR-377和CUL4A之間的結合位點；B.熒光素酶表達量的測定

2.5 下調CUL4A對Hela細胞發展的影響 由圖5可知，CUL4A在宮頸癌Hela細胞中的表達明顯高于H8細胞，CUL4A siRNA組細胞增殖能力、細胞侵襲數目明顯低于Control組或siRNA NC組，差異均有統計學意義(<0.01)。和Control組或siRNA NC組相比，CUL4A siRNA組E-cadherin表達明顯上升，N-cadherin表達明顯下降，Hela細胞劃痕愈合率明顯降低，差異均有統計學意義(<0.01)。

A.RT-qPCR檢測CUL4A在Hela和H8細胞中的表達量；B.CCK-8檢測下調CUL4A對Hela細胞增殖的影響；C.細胞侵襲實驗檢測下調CUL4A對Hela細胞侵襲的影響；D.Hela細胞的侵襲數目；E.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達量；F.E-cadherin、N-cadherin的相對表達量；G.細胞劃痕愈合實驗檢測下調CUL4A對Hela細胞遷移的影響；H.Hela細胞的劃痕愈合率

2.6 CUL4A通過cAMP/PKA對Hela細胞發展的影響 和Control組或pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-CUL4A組細胞內p-cAMP/cAMP和p-PKA/PKA比值升高(圖6A、B)；和Control組相比，H-89作用細胞后能夠明顯抑制PKA蛋白磷酸化水平(圖6C)；和pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-CUL4A組的細胞增殖能力、侵襲數目、N-cadherin表達和細胞劃痕愈合率升高、E-cadherin表達降低(圖6D-6I)；和pcDNA-CUL4A組相比，pcDNA-CUL4A+H-89組的細胞增殖能力、侵襲數目、N-cadherin表達和細胞劃痕愈合率均降低，E-cadherin表達升高；差異均有統計學意義(<0.01)。

A.Western blot檢測過表達CUL4A對cAMP/PKA通路的影響；B.p-cAMP/cAMP和p-PKA/PKA比值；C.Western blot檢測H-89作用細胞后對p-PKA、PKA表達的影響；D.CCK-8檢測過表達CUL4A通過cAMP/PKA通路對Hela細胞增殖的影響；E.細胞侵襲檢測過表達CUL4A通過cAMP/PKA通路對Hela細胞侵襲的影響；F.Hela細胞侵襲數目；G.Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin表達量；H.E-cadherin、N-cadherin相對表達量；I.Hela細胞的劃痕愈合率；J.細胞劃痕愈合實驗檢測下調CUL4A對Hela細胞遷移的影響

3 討論

研究表明在許多人類惡性腫瘤如室管膜瘤、胃腸道間質瘤和膠質瘤中，miR-377的表達被沉默。事實上，包括miR-377在內的14q32號染色體上的大miRNA簇被稱為最大的miRNA腫瘤抑制簇。近些年的研究發現，miR-377在調控基因表達、細胞增殖和信號轉導等方面具有豐富的功能，如miR-377的下調通過靶向HDAC9促進口腔鱗狀細胞癌的生長和遷移，另外發現miR-377靶向ETS1在人透明細胞腎細胞癌中發揮抑癌作用。而在本研究中，我們發現miR-377在宮頸癌組織和Hela、SiHa、Caski細胞中表達量明顯降低，且過表達miR-377降低了Hela細胞活力，抑制了癌細胞的侵襲，而下調miR-377則起到相反作用。提示miR-377可能在宮頸癌中起到抑制作用。

先前的研究表明miR-377能夠靶向frizzled類受體4，該受體是前列腺癌細胞上皮間質轉化和轉移所必需的。miR-377還被證明靶向細胞周期蛋白依賴性激酶6和E2F轉錄因子3。然而，目前還不清楚miR-377在宮頸癌細胞中是否靶向CUL4A。EMT是癌細胞轉移的重要過程。通過EMT，癌細胞在細胞外基質和血管基底膜獲得更強的移動和遷移到循環系統中的能力，并由此形成二次轉移。調控EMT在宮頸癌中的發生可能不僅是預測宮頸癌預后的重要生物標志物，也是進一步研究干預治療以更有效地抑制或阻斷宮頸癌轉移的重要靶點。泛素連接酶E3，根據泛素轉移方式的不同，分為環指E3泛素連接酶家族和與E6AP C端(HECT)泛素連接酶家族同源的兩大類，在泛素介導的蛋白質降解中起作用。CUL4A屬于cullin環基E3連接酶(CRLs)，是環指E3泛素連接酶家族的主要組成部分，首先在乳腺癌中被發現，其擴增與多種癌癥的發生和腫瘤轉移密切相關。CUL4A在卵巢癌組織和細胞系中高表達，是miR-377的直接靶點，其活性受miR-377的調控。本研究表明，在宮頸癌中miR-377靶向和負調控CUL4A，且進一步研究發現下調CUL4A降低了Hela細胞活力，抑制了癌細胞的侵襲和EMT。

許多信號轉導途徑，包括轉化生長因子β、絲裂原活化蛋白激酶、Notch和Wnt參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和EMT過程。如研究發現miR-377-3p通過上調GSK-3β表達和激活NF-κB通路在hCRC細胞中驅動惡性發展。還有文獻報道miR-377-3p、靶向XIAP和ZEB2負調控Wnt/catenin信號通路抑制結直腸癌。本研究表明過表達CUL4A激活了Hela細胞內cAMP/PKA信號通路，且通過該通路促進了癌細胞的發展。本研究結果提示miR-377靶向CUL4A可能通過cAMP/PKA信號通路抑制EMT過程，從而降低Hela細胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，本研究結果表明miR-377作為CUL4A的負性調節因子，導致宮頸癌細胞存活率和侵襲能力降低。本研究為深入了解宮頸癌的發病機制提供了理論依據，miR-377可能是宮頸癌患者的一個有希望的治愈靶點，值得進一步深入探討。