柴桂沙麥湯對肺陽虛小鼠炎癥細胞因子和脾臟T淋巴細胞亞群的影響*

郭澤樂，何麗清，儲開博，尹煉

（山西中醫藥大學，山西 晉中 030619）

肺陽虛證是指肺臟陽氣不足，溫煦失職引起機體功能衰退及一系列臨床表現的概稱，多見于外感及其他內傷雜病后期[1]。究其成因，多責之于外感寒邪，內傷生冷或久居陰寒之地。以往研究表明[2]，肺陽虛證會使機體免疫能力下降，增加機體感染的風險。目前西醫多采用抗炎抗病毒聯合抗生素進行治療[3]，但該治療手段所采用藥物多屬寒涼之品，在治療的同時也可能造成嚴重的副作用，不僅肺臟本體受損，更牽連到其他臟器，加重對機體的損害。中醫藥在治療肺陽虛證方面具有較好療效，在提高機體免疫力的同時能預防其他感染，能夠安全、高效地治療呼吸系統疾病[4]。柴胡桂枝湯是《傷寒論》中的經典名方，具有外散風寒、通調三焦氣機之功效。方中桂枝、生姜清太陽表寒，柴胡、黃芩通暢氣機，人參、炙甘草、大棗益氣健脾。肺為嬌臟，不耐寒燥，因此在選方治療方面，應著重考慮肺的功能屬性。柴桂沙麥湯是在柴胡桂枝湯的基礎上加沙參、麥冬而成，全方溫散但不傷正氣，升陽但無燥熱之弊。前期臨床觀察發現該方治療肺陽虛疾病具有很好的療效[5]，但是目前對于柴桂沙麥湯的免疫作用機制未深入了解。因此，本實驗擬探討柴桂沙麥湯對肺陽虛小鼠血清炎癥細胞因子和T淋巴細胞亞群水平的影響，研究柴桂沙麥湯可能的免疫作用機制，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級Bal b/c小鼠60只，雌雄各半，體質量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。本實驗小鼠飼養于山西中醫藥大學科研樓動物實驗中心動物房，飼養條件為室內溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，自然光照，自由飲食，飼養條件符合《實驗動物管理條件》要求，適應性喂養1周后開始實驗。本實驗研究方案獲得山西中醫藥大學醫學倫理委員會批準，批準編號：2020DW068。

1.2 藥物與試劑 柴桂沙麥湯（方藥組成：桂枝6 g，柴胡9 g，黃芩6 g，人參5 g，半夏6 g，白芍3 g，炙甘草3 g，大棗3 g，生姜3 g，麥冬5 g，沙參5 g）由山西中醫藥大學國醫堂藥房提供。APC Anti-mouse CD3 [17A2]（批號：20200311）、FITC Anti-mouse CD4[GK1.5]（批號：20201215)、PerCP-Cyanine5.5 Anti-mouse CD8a[53-6.7]（批號：20200607）均購自Tonbo Biosciences公司；小鼠白細胞介素-2（IL-2）ELISA檢測試劑盒（批號：20210319）、小鼠白細胞介素-6（IL-6）ELISA檢測試劑盒（批號：20210117）、小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（批號：20210216）均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 BSM120.4電子分析天平（上海卓精公司）；Infinite F50酶標分析儀（瑞士帝肯公司）；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；HW-1500A切片機（德國LEICA公司）；DHG干燥箱（上海一恒公司）；TG16-W離心機（湖南湘儀公司）。

1.4 造模與分組 60只Bal b/c小鼠適應性喂養1周后，采用完全隨機分組法分為空白組、模型組、柴桂沙麥湯低劑量組、柴桂沙麥湯中劑量組、柴桂沙麥湯高劑量組，每組12只。除空白組外，其余各組復制肺陽虛小鼠模型[6]。提前用冰塊制造0～4 ℃低溫環境，小鼠每日在此環境中冰凍1 h，結束后對小鼠實施冰水力竭游泳，此過程持續30 d。造模期間各組小鼠給予8%低蛋白飼料喂養，除空白組以外，其他各組小鼠給予冰水灌胃，2次/d，0.2 mL/次。若小鼠出現體質量下降、行動遲緩、拱背、反應力下降、愛扎堆、食欲不振并伴隨咳嗽、打噴嚏等情況，說明造模成功。

1.5 實驗給藥 柴桂沙麥湯低、中、高劑量組給藥濃度按照《藥理實驗方法學》[7]中人和動物間體表面積折算的等效劑量比計算，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組的藥物劑量分別為2.7、5.4、10.8 g/（kg·d）。造模成功后，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予不同劑量的柴桂沙麥湯。空白組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水[6]，1次/d，連續30 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 小鼠體質量、脾臟指數和胸腺指數[8]分別于第1、15、30天給藥前（禁食不禁水）測量小鼠體質量；第31天脫頸椎處死小鼠，用75%酒精對小鼠表皮進行消毒處理，在無菌環境下取出小鼠脾臟和胸腺，用生理鹽水沖洗器官表面殘血并用濾紙清理器官表面多余的水分，稱取器官濕質量，并按照公式分別計算脾臟指數和胸腺指數。脾臟（胸腺）指數=脾臟（胸腺）質量/體質量×10。

1.6.2 小鼠外周血清IL-2、IL-6和TNF-α水平 小鼠行眼球采血，室溫條件下靜置4 h，以4 000 r/min離心20 min，取上層血清，并按照ELISA試劑盒說明書進行操作，上機檢測血清IL-2、IL-6和TNF-α水平。

1.6.3 小鼠脾臟T淋巴細胞亞群 無菌條件取出脾臟，用PBS沖洗表面血污，將小鼠脾臟移入培養皿中，用5 mL注射器針栓研磨，200目過濾網過濾，制成脾臟淋巴細胞懸液，定容至5 mL，混勻收集。在1 000 r/min的條件下離心8 min，棄上清液，加入紅細胞裂解液，室溫條件下靜置5 min后，以1 000 r/min的條件離心8 min，棄上清液，加入5 mL PBS重懸混勻，同等條件下離心8 min，棄上清液，調整細胞濃度并用PBS清洗后定容至100μL，同時加入CD3、CD4、CD8三種抗體各1μL，避光染色20 min后加入500 μL PBS終止反應，以1 000 r/min的條件離心8 min，棄上清液，之后再加入500 μL PBS，以相同的條件離心后棄上清液，PBS定容至500 μL混勻上機檢測。實驗中所有樣本均制備陰性樣本。

1.6.4 小鼠肺組織形態學觀察 處死小鼠后，在無菌環境下取出小鼠肺組織，用生理鹽水沖洗表面血污，用濾紙擦干表面水分，在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋并切片，HE染色后鏡下觀察。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行分析。計量資料以“均數±標準差”（）表示，首先對數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，重復測量數據采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量比較 由于造模影響，各組小鼠體質量整體比較，差異有統計學意義（P＜0.05），存在分組效應，與空白組比較，模型組和柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠體質量均明顯降低（P＜0.05）。給藥第15、30天，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠體質量均明顯高于模型組（P＜0.05）。所有小鼠不同時間點體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，空白組和柴桂沙麥湯低、中、高劑量組均如此，存在時間效應；時間因素與組別因素存在交互效應，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見表1、圖1）

表1 各組小鼠體質量比較（）

表1 各組小鼠體質量比較（）

注：F時間主效應=100.476，P時間主效應=0.000；F分組主效應=85.889，P分組主效應=0.000；F交互效應=15.204，P交互效應=0.000；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較 與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數和胸腺指數均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠脾臟指數和胸腺指數均明顯升高（P＜0.05）；柴桂沙麥湯低、中、高劑量組間小鼠脾臟指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；柴桂沙麥湯高劑量組小鼠胸腺指數高于柴桂沙麥湯低劑量組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較（）

表2 各組小鼠脾臟指數、胸腺指數比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柴桂沙麥湯低劑量組比較，cP＜0.05

2.3 各組小鼠外周血清IL-2、IL-6和TNF-α水平含量比較 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-2水平明顯降低（P＜0.05），IL-6、TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠血清IL-2水平明顯升高（P＜0.05），IL-6、TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05），且柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠血清IL-2和IL-6水平呈劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）；柴桂沙麥湯中劑量組小鼠血清TNF-α水平低于柴桂沙麥湯低劑量組（P＜0.05）；柴桂沙麥湯高劑量組小鼠血清TNF-α水平與柴桂沙麥湯中劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠外周血清IL-2、IL-6、TNF-α 水平比較（）

表3 各組小鼠外周血清IL-2、IL-6、TNF-α 水平比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柴桂沙麥湯低劑量組比較，cP＜0.05；與柴桂沙麥湯中劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值比較 與空白組比較，模型組小鼠CD3+T淋巴細胞百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠CD3+T淋巴細胞百分比均明顯升高（P＜0.05），其中以柴桂沙麥湯高劑量組升高最為明顯，柴桂沙麥湯低、中劑量組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表4、圖2）

與空白組比較，模型組小鼠CD4+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值均明顯降低（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞百分比明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴桂沙麥湯中、高劑量組小鼠CD4+T淋巴細胞百分比明顯升高（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞百分比明顯降低（P＜0.05），CD4+/CD8+比值明顯升高（P＜0.05），其中以柴桂沙麥湯高劑量組最為明顯。柴桂沙麥湯低劑量組小鼠CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表4、圖3）

表4 各組小鼠脾臟CD3+T 淋巴細胞百分比比較（）

表4 各組小鼠脾臟CD3+T 淋巴細胞百分比比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柴桂沙麥湯低劑量組比較，cP＜0.05；與柴桂沙麥湯中劑量組比較，dP＜0.05

表5 各組小鼠脾臟CD4+、CD8+T 淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值比較（）

表5 各組小鼠脾臟CD4+、CD8+T 淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與柴桂沙麥湯低劑量組比較，cP＜0.05；與柴桂沙麥湯中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組小鼠肺組織病理形態比較 空白組小鼠肺組織無明顯異樣，肺泡及終末支氣管上皮細胞結構完整排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺泡出現明顯炎癥細胞浸潤，肺泡組織結構破壞，間隔縮小。柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠肺組織結構明顯好轉；柴桂沙麥湯低劑量組小鼠肺泡腔塌陷好轉，腔隙內炎癥細胞浸潤減少。柴桂沙麥湯中劑量組小鼠肺泡腔進一步好轉，腔內間隙明顯增寬；柴桂沙麥湯高劑量組小鼠肺組織改善最為明顯，但未恢復至空白組水平。（見圖4）

3 討 論

肺陽虛證先賢多有論述，從《難經·四十九難》中提到的“形寒飲冷則傷肺”和《黃帝內經》中提到的“重寒傷肺”及《金匱要略》中記載的“肺中冷”可以看出，本證成因系外傷風寒，肺先受病，內傷飲冷，脾陽不振，母病及子，致內外皆傷[9]。因此，本實驗以此為理論基礎，并且根據相關經驗[10-11]采用每日冰凍1 h模擬外邪犯肺，每日冰水力竭游泳模擬形寒勞倦，每日冰水灌胃以及低蛋白飲食模擬內飲生冷，陽氣不振，采用多種因素方法復制肺陽虛小鼠模型。結果顯示，小鼠行動能力變差，喜扎堆，鉆于墊料中，大便稀軟，體質量明顯降低，表明小鼠肺陽虛模型復制成功。外感寒邪，肺衛失固，因此出現惡寒等陽虛的表現；肺受寒則氣化不行，水液不布，脾陽不振，故大便溏。灌胃柴桂沙麥湯后，小鼠體質量逐漸恢復，精神狀態好轉，咳嗽、打噴嚏次數減少，行動能力改善，大便性狀改善。說明柴桂沙麥湯能改善小鼠肺陽虛癥狀。

相關研究表明，陽虛證候會引起機體免疫功能減退[12]。本實驗中模型組小鼠脾臟CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值明顯降低，CD8+T淋巴細胞百分比水平升高，IL-2細胞因子降低，這表明肺陽虛證會使機體免疫能力減退。柴胡桂枝湯由小柴胡湯、桂枝湯二方合成。根據相關報道[13-14]，臨床上依據肺陽虛患者外感風寒，營衛失和，內傷飲冷，傷正日久，邪氣內陷，陽氣虧虛的病機，選用柴胡桂枝湯治療肺陽虛患者具有較好療效。方中桂枝湯可以外散風寒，調和營衛，而小柴胡湯主要和解半表半里之邪，固護正氣，待大氣一轉，則機體陽氣升發，溫煦功能自然恢復。中國北方地區冬季多寒冷而干燥，飲食習慣多為膏粱厚味，容易形成虛實夾雜、寒熱錯雜之證，因此，本課題組將柴胡桂枝湯化裁，加入沙參和麥冬，改良成為柴桂沙麥湯[5]。柴桂沙麥湯以桂枝為君藥，發表散寒，辛溫通陽；人參、生姜、半夏為臣藥，益氣健脾，溫肺化痰，同時可助桂枝祛邪透表；方以柴胡、黃芩為佐藥，兩藥相合調理三焦氣機，肺胃得安；然肺為嬌臟，肺陽虛一證中以正氣虧虛為主，但若純用辛溫發散之品，恐溫燥傷肺，暗耗陰津，因而勤求古訓，“善補陽者，陰中求陽”，故于本方中加入甘涼清潤之沙參、麥冬與白芍，以上潤肺體，下滋腎陰。另以炙甘草為使，益氣和胃，配伍桂枝、生姜辛溫化陽，助解表散寒，配伍白芍、沙參和麥冬，以酸甘堅陰，同時可以制約桂枝、半夏之溫燥。全方配伍得當，調暢營衛與三焦，同時散寒升陽但無溫燥之弊，可做到標本兼顧。

現代醫學認為，脾臟和胸腺是重要的免疫器官，是衡量機體免疫能力的重要指標[15]。本實驗結果顯示，模型組小鼠脾臟、胸腺指數明顯低于空白組，可能由于外寒內飲的刺激，導致模型組小鼠免疫器官指數下降。柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠免疫器官指數明顯高于模型組，可能為方中人參、炙甘草等藥聯合作用的結果。同時，柴桂沙麥湯可以增加肺陽虛小鼠的體質量。MOSMANN T R等[16]將Th細胞分為Th1和Th2兩種功能不同的細胞因子亞群，IL-2、TNF-α主要由Th1細胞分泌，參與細胞免疫。IL-6主要由Th2細胞分泌，參與體液免疫。IL-2可促進淋巴細胞增殖、分化、生長，誘導免疫細胞分泌細胞因子發揮免疫效應，對機體抗病毒感染和增強免疫應答有重要作用，因此，IL-2水平是反映機體細胞免疫的重要標志。IL-6是一種作用廣泛的細胞因子，具有抗感染、調節免疫應答的作用，當單核巨噬細胞受到病毒的刺激時會產生大量的IL-6。同時，IL-6是機體炎癥反應最先出現的細胞因子，對于判斷急性炎癥具有重要作用。TNF-α主要是由單核巨噬細胞產生的內源性細胞因子。研究表明，少量的TNF-α具有抗炎屬性，可抑制機體炎癥反應和殺滅癌細胞，但是大量的TNF-α則變成促炎因子，會促進T細胞產生各種炎癥因子，進而誘發炎癥反應，引起機體器官組織的壞死[17-19]。IL-2可以反映機體免疫功能，IL-6和TNF-α都屬于促炎因子。當肺陽虛患者機體免疫能力降低時，易誘發炎癥反應，因此檢測炎癥細胞因子的表達，對于疾病的診療有著至關重要的作用。本研究發現，柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠血清IL-2水平明顯高于模型組，IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組，并且以柴桂沙麥湯中、高劑量組更為顯著，由此可以說明柴桂沙麥湯具有調節機體血清細胞因子、抑制炎癥反應、提高細胞免疫的作用。T淋巴細胞亞群主要用于監測機體細胞免疫功能。其中CD3+T淋巴細胞作用于成熟細胞表面，參與機體抗原應激反應。CD4+T淋巴細胞主要發揮免疫調節作用，可抑制免疫細胞的活化，從而避免機體發生免疫性疾病。CD8+T淋巴細胞是一種細胞毒性的T淋巴細胞，具有抗感染功能，可以殺滅被感染的靶細胞[20-21]，同時，CD4+/CD8+比值也可反映機體當前的免疫狀態。本研究發現，與空白組比較，模型組小鼠CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比明顯降低，CD8+T淋巴細胞百分比明顯升高，說明肺陽虛小鼠免疫功能下降；柴桂沙麥湯低、中、高劑量組小鼠CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值均明顯升高，CD8+T淋巴細胞百分比降低，并且以柴桂沙麥湯高劑量組效果更為明顯。

綜上所述，柴桂沙麥湯具有緩解肺陽虛小鼠癥狀的功效，能提高肺陽虛小鼠脾臟指數、胸腺指數及體質量，升高血清IL-2水平，降低血清IL-6、TNF-α水平，改善肺部形態結構，其作用機制可能與調節T淋巴細胞亞群的平衡，增強機體細胞免疫有關。