不同種屬骨顆粒腔隙結構Micro-CT三維可視化表征方法

朱 瀛 解茹越 張合虎 高 冰 劉 賢 韓魯佳

(中國農業大學工學院， 北京 100083)

0 引言

肉骨粉是對養殖動物屠宰場、肉品加工廠產生的新鮮無變質動物骨骼及廢棄組織經高溫高壓蒸煮、滅菌、脫膠、干燥粉碎后的一種重要的動物蛋白產品，其粗蛋白質量分數一般在40%～60%，氨基酸組分相對比較平衡，但品質變異較大。瘋牛病，又稱為牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)，屬一類人畜共患傳染病?？茖W研究表明，瘋牛病的引發和傳播是因食用攜帶朊病毒的牛羊源類動物肉骨粉所致，自1985年英國首次發現以來，受到瘋牛病牽連的國家多達100多個，造成了巨大的經濟損失和社會恐慌[1]。鑒于此，世界各國均嚴格禁止在反芻類動物飼料中添加肉骨粉[2-4]。因此，飼料中肉骨粉的檢測方法學研究一直是世界各國飼料安全領域的重點任務之一。

目前，肉骨粉的檢測方法主要有：顯微鏡法[5]、聚合酶鏈反應(PCR)法[6]和近紅外光譜分析(NIRS)法等[7-11]，其中顯微鏡法檢測標準在1998年由歐盟頒布實施并持續改進至今，一直被用作確證檢測，應用十分廣泛。肉骨粉顯微鏡檢測方法的基本原理是基于陸生和水生等不同來源肉骨粉顆粒腔隙等微觀結構形態特征的不同進行人工顯微鏡觀察和判別，其突出優勢是檢測精度高，但肉骨粉顯微鏡檢測時待測樣品需經嚴格干燥、粉碎、篩分、沉淀和懸浮物提取、染色、玻片制備等復雜、耗時的前處理，且顯微鏡肉眼觀察高度依賴檢測人員的專業技能水平。

顯微X射線計算機斷層成像(X-ray micro-computed tomography，Micro-CT)是一種先進的、非破壞性的3D成像技術，其成像原理是微焦點X射線球管發出的錐形X射線束透過樣本時，樣本各部位密度差異導致對X-射線吸收率不同從而在X-射線檢測器上呈現出不同的結構信息，對樣本進行360°成像后通過計算機軟件將每個角度的圖像進行重構還原成計算機可分析的3D圖像。與普通CT不同，Micro-CT空間分辨率極高，通常達到微米級，因而具有良好的“顯微”效果。 Micro-CT在無需對樣本進行破壞性預處理的情況下，原位、三維可視化地表征樣本的內部顯微結構，已在醫學[12-14]、地質[15-18]、材料[19-21]和農業[22-25]等多個領域得到研究與應用。

研究表明，Micro-CT的X射線被吸收的總量取決于它穿透物質的密度、原子組成以及X射線束的光能頻譜，在X射線能量一定的情況下，密度大的物質對射線的衰減更大[26-28]。骨與骨腔隙因構成不同存在一定的密度差異，骨與其腔隙Micro-CT的X射線吸收或衰減也會有所不同，理論而言，使用Micro-CT進行肉骨粉骨顆粒微觀形貌的分析是可行的。然而，骨顆粒腔隙通常會附著一些脂肪、蛋白質等物質，這些物質的密度介于骨與骨腔隙之間，因此在使用Micro-CT進行分析時，需輔以機器學習算法進行圖像閾值分割處理才能準確獲取骨顆粒內部顯微結構特征信息。

為了探究使用Micro-CT原位、三維、可視化表征肉骨粉中骨顆粒顯微結構特征信息的可行性，本文以水生(魚骨)和陸生(牛、豬、雞)動物源骨顆粒為對象，開展基于Micro-CT的水生和陸生動物源肉骨粉顆粒的顯微結構分析研究，以期為建立飼料中不同動物源成分的快速分析方法提供技術支撐。

1 表征方法

1.1 不同動物源肉骨粉及其骨顆粒樣品

研究所用不同動物源肉骨粉源于筆者所在實驗室動物源飼料樣品庫，樣品均為避光密封4℃恒溫保存。其中，魚粉、牛骨粉、豬骨粉和雞骨粉分別采自黑龍江省、山東省、江蘇省和河北省相關企業。

從上述每種肉骨粉樣品中分別隨機選取10個骨顆粒用于Micro-CT掃描和重構條件優化，隨后再從中各隨機選取3個骨顆粒用于圖像分割方法的比較和原位三維可視化和斷層結構表征。

1.2 分析儀器

德國徠卡公司DM 2500型生物顯微鏡，配備DFC420C型CCD攝像頭和Leica Application Suite V3.30專用圖像分析軟件。

比利時Bruker公司Skyscan 1275型Micro-CT，電壓范圍20～100 kV，最大功率為10 W，360°掃描，空間分辨率6～50 μm，配置3MP(1 944像素×1 536像素)有源像素平板探測器。

1.3 不同動物源肉骨粉樣品的顯微鏡分析

按照飼料中動物源性成分檢測顯微鏡法[29]，對不同動物源肉骨粉樣品進行沉淀、脫脂、染色、風干、制片預處理，然后顯微鏡觀察，獲取不同動物源骨顆粒樣品的顯微鏡圖譜，用作不同種屬肉骨粉骨顆粒樣品顯微結構基準。

1.4 基于Micro-CT的不同動物源肉骨粉骨顆粒顯微結構的原位、三維可視化表征方法

1.4.1Micro-CT掃描條件優化

使用Bruker Skyscan 1275型Micro-CT，對上述不同動物源肉骨粉樣品進行掃描。掃描前，無需任何預處理，直接用石蠟將樣品固定在儀器圓形載物臺上，避免掃描過程中晃動。

鑒于電壓和電流是影響掃描圖像質量的重要因素，將顆粒樣品分別在50 kV/200 μA、80 kV/125 μA和100 kV/100 μA的條件下進行掃描，根據掃描時X射線透過率的最大、最小和平均值，確定最優掃描電壓和電流為80 kV、125 μA。

1.4.2Micro-CT數據采集及數據去噪

Micro-CT數據采集采用360°掃描、圖像分辨率8 μm、旋轉步長0.20°、圖像2幀取平均(即掃描過程中樣品每旋轉0.20°獲取2幀圖像取平均計算)、曝光時間46 ms。

通過調整軟件Ring-Artifacts值(分別設置為1、2、3、4和5后進行圖像預覽)進行環形偽影消除，使用軟件Beam-hardening Artifacts進行杯狀偽影校正(分別設置為10%、20%、30%、40%和50%后進行圖像預覽)。調整軟件Smoothing值(分別設定為0、1、2、3和4后預覽圖像)和Post-Alignment值(分別設定為-1.0、-0.5、0、0.5和1.0后預覽圖像)以減少掃描過程中樣品輕微晃動可能導致的重構圖像出現偏差。通過預覽比較獲取的圖像效果，Micro-CT圖像重構條件確定為：Ring-Artifacts 3，Beam-hardening 30%，Smoothing 1和Post-Alignment 0。

1.4.3Micro-CT圖像三維重構算法

使用Skyscan NRecon軟件(Bruker Skyscan,比利時)對Micro-CT圖像進行三維重構。所有樣品圖像均在X射線吸收系數為0～0.062的范圍內進行重構，得到的灰階為0到255的8位BMP圖像。

分別采用簡單全局分割法(Global)[30-31]、自適應全局分割法(Otsu)[32]、K-means全局聚類分割法(K-means)以及局部均值自適應均值分割法(Adaptive mean-C)和局部中值自適應分割法(Adaptive median-C)[33]進行圖像分割與參數優化。

經預試驗，采用Global計算時，將樣品所有重構圖像(80幅)閾值統一設定為100進行二值化處理；Otsu算法則據每幅圖像分別進行計算自動獲取閾值，閾值變化范圍為94～103。

使用Matlab 2019軟件中的自適應閾值(Adaptive threshold)函數對樣品圖像進行計算。采用控制變量法對自適應分割法函數中的局部運算區域(WS)和修正值(C)的選取進行優化，具體如下：固定WS為5，分別設定C為-2、-1、0、1、2對各樣品重構后的圖像進行處理，對結果進行分析，同理固定C為0，分別設定WS為1、3、5、7、9對圖像進行處理并分析。

1.4.4骨顆粒顯微結構原位可視化

采用優化后的閾值分割參數對各樣品重構圖像進行二值化處理，將獲取的二值化圖像導入CT Vox軟件和DataViewer軟件中，分別獲取三維顯微結構圖像和顯微斷層結構圖像。圖像中骨結構渲染為紅色、腔隙結構渲染為黑色。

2 結果與討論

2.1 不同動物源肉骨粉的顯微鏡圖譜

經顯微鏡檢測獲得的不同種屬肉骨粉骨顆粒顯微鏡圖像如圖1所示。

圖1 不同動物源骨顆粒顯微鏡檢測成像結果Fig.1 Microscopic imaging results of bone particles from different animals

由圖1可以看出，魚骨顆粒呈細長管狀，邊角銳利，黑色骨腔隙呈細長型分布于骨顆粒中間。牛骨、豬骨、雞骨顆粒為不規則多邊體，黑色腔隙呈橢圓形。由此可知，魚骨與牛骨、豬骨和雞骨在整體輪廓和骨腔隙形狀上有明顯差異，這也是可通過顯微鏡檢測的方法進行水生和陸生動物源肉骨粉判別的主要依據。

2.2 基于不同圖像閾值分割方法的Micro-CT圖像比較

圖2為經不同閾值分割方法處理不同動物源骨顆粒樣品的Micro-CT斷層成像變化，其中Global法閾值設定為100，Otsu法閾值根據每幅圖像自動獲取，Adaptive median-C法預設WS為5、C為0，K-means法設置分類數為3。

圖2 經不同閾值分割算法處理不同動物源骨顆粒的Micro-CT斷層圖像Fig.2 Micro-CT tomographies of different bone particles processed by different threshold segmentation algorithms

由圖2可知，采用2種全局閾值分割法(Global和Otsu)獲取的二值化圖像結果較為相近，其結果僅呈現出了骨顆粒的基本輪廓，并無任何腔隙結構信息。采用K-means法獲取的灰度圖像是依據原始圖像各像素點的灰度將圖像分為3類，分別為背景、骨顆粒外輪廓和骨顆粒內部，但骨顆粒內部圖像無腔隙結構特征。由此可知，骨顆粒內部由于有骨腔隙結構存在的整體灰度低于外輪廓，但顆粒內部區域灰度較為相近，僅通過設定單一的全局閾值無法獲取骨腔隙的結構特征。而經2種局部閾值分割法處理的成像中則呈現出了較多的骨腔隙信息，這是由于該類方法是基于樣品圖像中每個像素點周圍的區域進行計算，故這類被脂肪等物質包裹的體積較小的骨腔隙，由于其平均密度小于區域內的骨結構密度，依然會被定義為腔隙結構。對比2種局部自適應分割法結果，可以看出采用Adaptive mean-C法獲取的圖像與原始圖像中的部分腔隙結構差距較大，且結果圖像中骨顆粒的邊緣出現多處開口現象，這也與顆粒實際情況不符，而Adaptive median-C法處理的圖像結果與原始圖較為相近，適合作為骨顆粒腔隙特征的表征方法。同時需要進一步討論該方法中的WS和C 2個參數對圖像結果的影響。

采用Adaptive mean-C法的參數優化結果如圖3所示(從上到下4幅圖像依次為魚骨、牛骨、豬骨、雞骨)。由圖3可知，Adaptive mean-C函數中C修正的是骨腔隙半徑，當C由0逐漸減小時部分體積較小的腔隙會消失，而當C逐漸增大時，部分距離相近的腔隙會發生連通現象。同時，函數中的WS影響的是局部閾值計算區域的尺寸?？梢钥闯?，當WS值過小時，結果逐漸趨近于全局閾值分割的圖像，當WS值過大時，骨腔隙的半徑會偏大，甚至一些距離較近的腔隙會連接在一起。對照圖1，優化的Adaptive mean-C法表征骨顆粒腔隙特征的參數WS為5，C為0。

圖3 基于Adaptive mean-C閾值分割算法的不同動物源骨顆粒成像結果比較Fig.3 Results of different bone particles pictures dealt with different parameters of Adaptive mean-C method

2.3 不同動物源骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維可視化表征結果

圖4～7所示為4種不同動物源骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維可視化表征和沿z軸由下至上的5個x-y斷層圖像結果。

由圖4可以看出，魚骨樣品呈細長管狀，斷層魚骨的黑色骨腔隙均沿骨顆粒中間呈細長狀分布，此為中國農業行業標準NY/T 3002—2016[29]以及圖1顯微鏡圖像所示的魚骨的典型結構特征。由圖5～7可知，牛、豬和雞骨顆粒樣品斷層均呈現為不規則多邊體，其腔隙結構多呈不規則分布于骨顆粒內部，這也與相關標準和顯微鏡圖像所呈現的骨顆粒及其腔隙結構和分布具有較好的一致性。上述結果表明，采用Micro-CT方法，無需進行顯微鏡檢測所需的繁瑣的樣品預處理，直接通過觀察樣品腔隙結構特征的不同，即可實現對水生和陸生動物源肉骨粉的有效鑒別。

圖4 魚骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結果Fig.4 Micro-CT 3D in-situ visualization of fish bone particles

由圖5～7還可看出，牛、豬和雞骨腔隙結構分割精度還有待進一步提高。下一步研究將采用其它深度學習算法，以期實現對不同動物源骨顆粒腔隙結構的精準分割，提高不同種屬骨顆粒腔隙形態結構的Micro-CT原位三維可視化表征的精度。

圖5 牛骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結果Fig.5 Micro-CT 3D in-situ visualization of bovine bone particles

圖6 豬骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結果Fig.6 Micro-CT 3D in-situ visualization of porcine bone particles

圖7 雞骨顆粒顯微結構的Micro-CT原位三維斷層可視化表征結果Fig.7 Micro-CT 3D in-situ visualization of chicken bone particles

3 結論

(1)建立了一種基于Micro-CT和Adaptive mean-C圖像分割算法的不同種屬肉骨粉骨顆粒腔隙結構三維原位可視化表征方法。

(2)優化掃描條件為電壓80 kV、電流125 μA、圖像分辨率8 μm、旋轉步長0.20°、曝光時間46 ms和360°掃描；優化圖像三維重構條件為Smoothing 1、Post-Alignment 0、Ring-Artifacts 3和Beam-hardening 30%。

(3)優化Adaptive mean-C函數參數為WS為5，C為0。基于Micro-CT的骨顆粒顯微形態結構表征結果與顯微鏡檢測結果較為一致。研究結果為豐富水生和陸生動物源飼料的快速、無損判別分析提供了技術支撐。