天然蠶絲混合再生蠶絲緯編針織網的生物學性能*

唐靚，張文元，李躍中

（杭州醫學院1.食品科學與工程學院；2.生物工程學院，浙江 杭州 310013）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament,ACL）斷裂無法自愈［1］。組織工程技術的發展和應用為ACL 重建提供了新的思路和方法［2］。找到合適的生物材料作為一個潛在的支架是組織工程ACL 的關鍵因素，它必須是生物相容性和可生物降解的，以允許組織長入，并具有優異的力學性能。支架降解速率應與組織長入支架速率相匹配，即降解時間要求同韌帶再生的周期相匹配，以及與之匹配的力學性能，并可模擬組織界面特性，這對于新生韌帶的形成至關重要。蠶絲脫膠后獲得的蠶絲絲素纖維具有獨特而非凡機械強度和韌性，具有輕比重、高強度、良好的黏彈性和熱穩定性［3］，緩慢的可生物降解性，最小限度炎癥反應，已成為用于組織工程韌帶很有吸引力的候選材料。天然蠶絲絲素纖維降解緩慢可為細胞生長提供長久的支持，長期保持優良的機械性能。但也因降解緩慢，不能及時騰出空間導致阻礙組織的再生。許多研究結果表明，由于再生蠶絲絲素有一些化學鍵被打斷，一些一級結構與高級結構發生了改變，以至于再生蠶絲絲素材料（例如纖維、膜或多孔海綿狀材料）的降解速率明顯快于天然蠶絲絲素纖維［4-6］。因此，本實驗采用天然絲素纖維與再生絲素纖維混合緯編針織成網狀支架，適當調節支架的降解速度。并通過維生素C 誘導制備骨髓間充質干細胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）細胞片，覆蓋于天然絲素纖維混合再生絲素纖維的緯編針織網上體外培養，觀察細胞在支架上的生長情況，并測試其機械強度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 mg/mL ? 型鼠尾膠原（杭州生友生物技術有限公司），α-MEM（HyClone），胎牛血清（上海翌圣）。2 wt%再生絲素溶液由本實驗室自制［7］。桑蠶絲（Bombyx Morisilk）、再生蠶絲蛋白纖維購于杭州絲綢市場。新西蘭白兔，3 月齡，雌雄不限，約2 kg，生產許可證號：SCXK（浙）2020-0005，新昌縣大市聚鎮欣健兔場提供。

1.2 儀器與設備

掃描電鏡（SEM,XL30-ESEM,Philips-FEI,荷蘭），拉力機（QX-W300,上海企想檢測儀器有限公司），冷凍干燥機（LL3000,丹麥HetoPowerDry公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 兔BMSCs 提取 參照文獻［8］，從新西蘭白兔髂骨抽取骨髓，通過密度梯度離心結合貼壁培養法分離、純化BMSCs。并傳代培養。

1.3.2 BMSCs 細胞片的制備 將處于對數生長期的BMSCs 以1×106cells/mL 接種到6 孔板中，37℃、5%CO2培養，隔天換液，待細胞長到近100%時，更換為細胞片誘導液（α-MEM 完全培養基+50μg/mL 維生素C）。培養7 d 后培養板底部可見乳白色半透明膜片形成，用細胞刮刀將其從培養板底完整剝離。

1.3.3 蠶絲纖維針織網支架制備 參照文獻［9］，蠶絲通過0.5%Na2CO3溶液煮沸兩次，脫去絲膠，得到蠶絲絲素纖維細絲，即為天然蠶絲纖維。按天然蠶絲纖維、再生蠶絲纖維比例約為1∶1 的質量比（含天然蠶絲纖維100根，再生蠶絲蛋白纖維35 根）均勻混合平行排列，逆時針扭合（2 捻）成1 小束（共含纖維單絲270 根）。再將纖維小束按圖1 緯編針織成網狀物（30 mm×5 mm）。然后將2 wt%再生絲素與5 mg/mL I 型膠原以1∶1 混勻滴加充填于絲網中，盡量使其浸透，-80℃冰箱過夜，置于凍干機凍干。環氧乙烷消毒備用。掃描電鏡（SEM）觀察。

圖1 緯編針織示意圖

1.3.4 支架-BMSCs 細胞片復合物的體外培養 將BMSCs 細胞片覆蓋纏繞于1.3.3 項已消毒的蠶絲網/膠原-絲素海綿支架上，以絲線稍作固定。37℃、5% CO2培養，1 d 后去除絲線，共培養2周。取1 個支架-BMSCs 細胞片復合物，按細胞SEM 觀察的操作規程處理后，行SEM 觀察。

1.3.5 支架-BMSCs 細胞片復合物的機械強度檢測 取1.3.4 項已培養2 周的支架-BMSCs 細胞片復合物樣本6個，參照文獻［9］用拉力機進行機械強度測試。將試樣固定于拉力機上，拉力至1 N時測其橫截面積及夾具間距長度，再以拉伸速度50 mm/min 進行拉伸試驗，記錄最大載荷、拉伸強度、彈性模量等力學指標。

2 結果

2.1 BMSCs 培養及傳代

骨髓經密度梯度離心結合貼壁培養法后，獲得BMSCs。通過原代、傳代培養，第三代BMSCs生長旺盛，呈長梭形均勻分布生長，增殖迅速（圖2）。

圖2 BMSCs 傳代培養2 d 后呈長梭形均勻分布生長，增殖迅速（×100）

2.2 天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的針織網的SEM 觀察

天然蠶絲纖維較細，再生蠶絲纖維較粗（圖3A）。蠶絲纖維針織網有較大的孔隙，伸縮性和柔軟性良好，并具有足夠的內部空間（圖3B）。于蠶絲纖維針織網上滴加的絲素-膠原凍干后成海綿狀（圖3C），可提供細胞停泊、黏附、增殖、遷移場所，以適于種子細胞的生長。

圖3 天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的緯編針織網SEM 觀察

2.3 BMSCs 在支架材料上增殖、生長的SEM 觀察情況

復合培養2周，BMSCs 細胞附于天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的緯編針織網支架上生長，增殖良好，形態較佳，呈立體狀生長，并分泌基質（圖4）。

圖4 BMSCs 于支架上的SEM 觀察（×1000）

2.4 針織網-細胞片復合物的機械強度測定

天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合針織網-BMSCs 細胞片復合物培養2 周后，其最大載荷、拉伸強度、彈性模量分別為（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa。

3 討論

傳統的組織工程韌帶移植后，關節腔內細胞數量不足是導致預后不良的主要原因之一［10-11］。目前的細胞播種技術存在細胞附著效率低、細胞活性差、細胞利用率低等缺點，細胞凝膠復合材料黏附支架強度有限，不能將大量的細胞整合到密集的移植物中等問題［12-13］。即這種支架的一個局限性是它的低孔隙率抑制了細胞的負載和浸潤。這些問題需要進一步的研究來改善細胞與支架的組裝［14］。因此，人們希望找到加速移植物-骨整合的策略，這將減少生物固定的時間，提高生物固定的可靠性，允許加速康復，并潛在地減少早期移植物拔出和晚期移植物本體失效的發生率。細胞片技術可以很好地解決細胞流失的問題，且費用較低。利用細胞片新模式，以擴大種子細胞的負載，在一定程度上有效地解決了細胞流失的問題，促進細胞外基質（ECM）沉積和良好的界面整合［15］。在蠶絲針織網空隙中添加再生絲素-膠原進行凍干形成海綿狀多孔結構，可提供種子細胞停泊、黏附、增殖、遷移場所，防止細胞從支架上漏掉，增加“韌帶化”程度，促進細胞沉積和韌帶組織再生。同時為后來細胞生長及新組織形成預留了內部空間。

相對于膠原來說，再生絲素蛋白的降解速度相對較慢。膠原最先降解，再生絲素次之降解，天然絲素纖維最后降解，可形成一定的梯度降解作用。絲素蛋白纖維降解緩慢，可在一定時期提供機械支持。隨著膠原、再生絲素、天然絲素纖維的梯度降解，可為細胞生長及新組織形成提供空間，而且絲素可降解為數種氨基酸，對修復組織也有部分營養作用。

種子細胞是韌帶組織工程化的關鍵因素，理想的種子細胞需要良好的增殖能力，并能持續分泌特定的ECM，來維持并修復功能的損失。BMSCs 是組織工程常用的成體干細胞，具有獲取容易，增殖能力強及多向分化功能［16-17］，是較為理想的韌帶組織工程種子細胞。本實驗采用支架覆蓋BMSCs 細胞片的模式，以擴大種子細胞的負載。

蠶絲支架雖然目前在動物實驗中應用廣泛，但真正應用于臨床還有很長的路要走。未來蠶絲組織工程韌帶的發展方向，一方面可以提高和改善蠶絲性能和蠶絲支架結構［18］，更好地與種子細胞相結合，并可與生長因子或其他材料聯合應用，以滿足臨床中ACL 修復的更高需求［19］。

本實驗結果表明，BMSCs 細胞片附于充填膠原-絲素海綿的天然蠶絲混合再生蠶絲針織網上復合培養2周，BMSCs 細胞附于支架上生長良好，呈立體狀，增殖旺盛，并分泌基質。針織網-BMSCs 細胞片復合物培養2 周后的最大載荷、抗拉強度、彈性模量分別為（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa，機械強度良好，為后續進一步研究與應用打下基礎。