極度瀕危植物狹葉坡壘種子脫水敏感性研究

黃 寧，劉雄盛，廖南燕，王仁杰，黃榮林，蔣 燚，肖玉菲，王凌暉

（1.廣西大學，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西優質用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧 530002；3.廣西防城金花茶國家級自然保護區，廣西防城港 538021）

種子是植物種群繁衍、更新和擴散的基礎。根據種子貯藏特性，可將其分為正常性種子、中間性種子和頑拗性種子[1]。其中，頑拗性種子在脫離母株前未經干燥失水，脫離母株后含水率較高（30%～60%），內部代謝較活躍，一旦遭遇干旱，種子會快速失水，加劇膜脂過氧化作用，破壞細胞膜結構和功能，導致自由基積累和抗氧化保護系統活性降低，致使細胞內部生理代謝活動紊亂[2-3]。當種子脫水超過某一臨界值時，種子的壽命和活力將大幅降低，甚至完全失活而不能萌發[2]。珍稀瀕危植物金絲李（Garcinia paucinervis）種子失水率超過18.0%時，其萌發率顯著下降；失水率達42.0%時，種子完全失活，萌發率為0[4]。銀杏（Ginkgo biloba）種子含水量降至40.1%時，發芽率降至50.0%；含水量降至25.0%時，種子萌發率降至20.0%，SOD 活性達最大值[5]。掌握頑拗性種子的脫水敏感性和生理生化特征對植物種質資源保存、苗木培育及引種栽培均有深遠意義[5]。

狹葉坡壘（Hopea chinensis）為龍腦香科（Dip?terocarpaceae）坡壘屬常綠喬木，為桂南北熱帶常綠季雨林代表樹種之一，對研究熱帶雨林區系構成、地理分布和生態習性有重要價值。其材質堅硬，耐腐力極強，被稱為“萬年木”，可應用在軍工、機械和高級家具等領域；樹皮具龍袍狀花紋，亦有“龍袍樹”之稱[6]。狹葉坡壘為第三紀殘留種，分布在局部地形形成的“避難所”中，原分布于廣西十萬大山和大青山海拔600 m 以下的山麓、溝谷和山坡林中；由于人類活動，其生境喪失，個體數量下降，現只在廣西十萬大山區域內還有少量野生狹葉坡壘分布，已被《國家重點保護野生植物名錄》列為國家Ⅱ級保護植物，被世界自然保護聯盟（IUCN）列為極危（CR）物種[7]，對其進行野生資源保護及人工擴繁迫在眉睫。

目前，對狹葉坡壘的研究主要集中在種群生態學特征[6，8]、光合特性[9]和遷地保護[7，10]等方面。唐文秀等[11]研究指出，狹葉坡壘種子含水量高，無休眠，易萌發，但若外界條件不合適，種子會很快失活，是典型的頑拗性種子。目前，關于狹葉坡壘種子生理學特性的研究較少，嚴重限制其種質資源的保存與利用。本研究通過定時測定自然脫水條件下狹葉坡壘種子的含水率，并測定種子萌發率、萌發勢和萌發指數等萌發參數及超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性及電導率和丙二醛（MDA）含量等生理指標，旨在探明其脫水敏感性及脫水條件下的生理特性，為狹葉坡壘種子保存及其保育和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年1月，在廣西防城金花茶國家級自然保護區南山站（108°02′E，21°43′N）野生狹葉坡壘種群采集狹葉坡壘種子。為保證種子成熟度，所有種子均在從母樹上自然脫落期間采集。采集后立即帶回實驗室，去除雜質后立即開展基本生物學測定和萌發試驗。所有采集活動均獲得當地管理部門和主管部門許可。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子基本特征和含水率測定

參照GB 2772-1999《林木種子檢驗規程》[12]，采用四分法，隨機選取50 顆種翅完整的健康種子，重復3次；采用游標卡尺（精度為0.01 mm）測量每粒種子的種翅長、種翅寬、種子長和種子寬4個形態指標（由于狹葉坡壘種子為圓形或橢圓形，僅測定種子長和寬，長度、寬度均選擇樣品的最長和最寬處進行測量），并計算種翅長寬比和種子長寬比。

采用四分法，隨機挑選100粒健康種子，去種翅后，采用電子天平（精度為0.01 g）稱重，重復5次，計算種子千粒重。

采用低恒溫烘干法測定種子含水量。隨機選取30 粒去種翅健康種子，在103 ℃下烘至恒重，重復3次。計算種子含水率（MC，%），計算公式為[12]：

1.2.2 種子脫水處理

參照張俊杰等[4]和文彬等[13]的方法，將采集后的狹葉坡壘種子攤開置于室內陰涼通風處，使其自然脫水，期間日均溫為16.0 ～ 18.0 ℃，空氣濕度為70%～85%。每2天取樣1次，分為4份，1份用于種子含水率測定，1 份用于種子萌發特性測定，1 份用于種子相對電導率（RC）測定，另1份用于MDA含量及SOD和CAT活性測定。種子自然脫水持續20天，共取樣10次。

1.2.3 脫水種子萌發試驗

每次取樣時，隨機選取90 粒種子，用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡消毒5 min，流水沖洗后，分為3 個重復，每重復30 粒去種翅的健康種子，置于鋪有2 層濾紙的120 mm 規格的培養皿中，放入條件為25 ℃、3 000 Lux 12 h/d 和80%相對濕度的培養箱內萌發。每天定時觀察和記錄種子萌發情況，并補充適量水分。20 天后結束試驗，每重復隨機選取10 株幼苗，分別測定幼苗根長和芽長（不足10 株則全部測量）。

種子萌發指標包括萌發率（GP，%）、發芽勢（GE，%）、萌發指數（GI）、萌發時滯（GD，d）、萌發歷期（D，d）及活力指數（VI），計算公式為[4,14-15]：

式中，Gt為第t天萌發的種子數；Dt為萌發天數。

GD 為第一粒種子萌發所需天數；D 為第一粒種子和最后一粒種子萌發的時間差。

式中，Lr和Ls分別為萌發試驗結束時幼苗的根長（cm）和芽長（cm）（本研究中幼苗根長為胚根及胚軸的總長度）。

1.2.4 脫水種子生理指標測定

每次取樣時，隨機選取90粒種子，去種皮后，分為3 個重復，每重復30 粒，用電導儀測定種子相對電導率（RC）。隨機取30 粒種子，去種皮后，分為3個重復，每重復10 粒，液氮極速冷凍后，保存于-80 ℃冰箱內。采用硫代巴比妥酸法測定種子MDA含量，采用氮藍四唑法測定SOD 活性，采用紫外吸收法測定CAT活性[16]。

1.3 數據處理

采用Excel 2016 軟件對種子形態、萌發和生理性狀數據進行統計和作圖。采用SPSS 19.0 軟件對種子萌發和生理指標進行方差分析和多重比較（采用鄧肯氏新復極差法）；采用Pearson 相關系數對萌發和生理指標進行相關性分析。以上統計分析顯著性水平均設定為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 狹葉坡壘種子大小與含水率

狹葉坡壘種子呈卵圓形，被增長的5枚花萼裂片基部包裹，其中2枚花萼裂片增大為長圓狀披針形或長圓形的翅。在廣西防城港，狹葉坡壘種子每年12月—翌年1月成熟，成熟種子長為（13.67±1.06）mm，種子寬為（10.16 ± 0.82）mm，種子長寬比為（1.36 ±0.04）；種翅長為（7.45 ± 0.77）cm，種翅寬為（1.85 ±0.04）cm，種翅長寬比為（4.04±0.17）；種子千粒重為（470.73±25.55）g，種子含水率為（42.57±0.91）%。

2.2 自然脫水條件下種子含水率變化

狹葉坡壘種子初始含水率為42.57%；隨脫水時間增加，種子含水率逐漸降低，呈二項式模型（圖1）。不同脫水時間下，種子含水率差異極顯著（P<0.01）。0～6天，種子含水率下降較快；6～14 天，種子含水率下降速度較慢；14～18 天，種子含水率下降速度較快；至18 天時，種子含水率為18.91%，比初始含水率降低55.58%。

圖1 不同脫水時間狹葉坡壘種子含水率變化Fig.1 Changes of moisture contents of H.chinensis seeds in different desiccation days

2.3 脫水種子萌發特性

不同脫水時間下，狹葉坡壘種子的萌發動態差異較大（圖2）。脫水0 天的種子（新鮮種子）在萌發試驗開始2天后開始萌發，3～12天為種子萌發高峰期，12～20 天萌發速度變緩。脫水2 和4 天的種子在萌發試驗開始3天后開始萌發，4～10天為種子萌發高峰期，10～17 天萌發速度變緩，之后逐漸停止萌發。脫水6 天的種子在萌發試驗開始5 天后開始萌發，6 ～ 13 天為種子萌發高峰期，13 ～ 17 天萌發速度變緩，17 天后逐漸停止萌發。脫水8 天的種子在萌發試驗開始6天后開始萌發，7～11天為種子萌發高峰期，11～16 天萌發速度變緩，16 天后逐漸停止萌發。脫水10 天的種子在萌發試驗開始7 天后開始萌發，8～11天為種子萌發高峰期，11～15天萌發速度變緩，15天后逐漸停止萌發。脫水12天的種子在萌發試驗開始8天后開始萌發，9～11天為種子萌發高峰期，11～15 天萌發速度變緩，15 天后逐漸停止萌發。脫水14 天的種子在萌發試驗開始9 天后開始萌發，10 ～ 11 天為種子萌發高峰期，11 ～ 15天萌發速度變緩，15 天后逐漸停止萌發。脫水16和18天的種子均失去活力，不能萌發。

圖2 不同脫水時間狹葉坡壘種子萌發動態Fig.2 Germination dynamics of H.chinensis seeds in different desiccation days

不同脫水時間下，狹葉坡壘的種子萌發率、發芽勢、萌發指數、萌發時滯、萌發歷期、活力指數、根長和芽長均差異極顯著（P< 0.01）（圖3）。隨脫水時間增加，種子萌發率、發芽勢、萌發指數、萌發歷期、活力指數、根長和芽長均逐漸降低，萌發時滯逐漸增加。自然脫水0 ～ 4 天時，種子萌發率下降速度較慢；0 天時，種子萌發率為90.00%；4 天時，種子萌發率為83.33%，比0 天時下降7.41%。4 ～ 16 天時，種子萌發率快速下降；8 天時，種子萌發率降至51.67%，接近半致死；16 天時，種子完全失去活力，不能萌發。若以種子半致死率衡量種子壽命，狹葉坡壘種子壽命僅8天，16天后完全喪失活力。

圖3 不同脫水時間狹葉坡壘種子萌發特性Fig.3 Germination characters of H.chinensis seeds in different desiccation days

自然脫水0 天時，種子發芽勢為31.67%；4 天時，種子發芽勢為25.00%，下降速度較慢；4天后，快速下降；10 天時，發芽勢降為0。自然脫水0 天時，種子萌發指數為2.32；隨脫水時間增加，萌發指數顯著下降（P<0.05）；16天時降至0。自然脫水0天時，種子萌發時滯為2.8 天，與自然脫水2 和4 天的種子萌發時滯差異不顯著；4 天后，種子萌發時滯顯著上升（P< 0.05）；14 天時，種子萌發時滯為9.7 天。自然脫水0 天時，種子活力指數和萌發歷期分別為29.18 和15.7 天，之后顯著下降（P<0.05）；14 天時，種子活力指數和萌發歷期分別為1.39 和3.3 天，下降幅度分別為95.24%和78.98%。

不同脫水時間下，種子根長和芽長變化趨勢基本一致，均呈逐漸下降趨勢。自然脫水0天時，根長和芽長分別為6.16 和6.41 cm；0～4 天時，根長和芽長下降速度緩慢；4天后，快速下降；14天時，根長和芽長分別為4.36 和1.88 cm，下降幅度分別為29.22%和70.67%。

2.4 脫水種子生理特性

不同脫水時間下，狹葉坡壘種子的相對電導率、MDA 含量及SOD 和CAT 活性均差異極顯著（P<0.01）（圖4）。隨脫水時間增加，種子相對電導率和MDA 含量均逐漸增加；SOD 活性呈“W”型，波動性升降；CAT 活性呈先升后降的趨勢。自然脫水0 天時，種子相對電導率和MDA 含量分別為53.40%和31.93 μmol/g；18天時，種子相對電導率和MDA含量分別為105.87%和202.83 μmol/g，增幅分別為98.26%和535.23%。

圖4 不同脫水時間狹葉坡壘種子生理變化Fig.4 Physiological changes of H.chinensis seeds in different desiccation days

自然脫水0 天時，種子SOD 活性為459.14 U/g；之后降低，4天時降至436.74 U/g；之后上升，10天時升至最高（595.50 U/g）；之后又逐漸降低，14 天時降至最低（436.39 U/g）；之后又上升。自然脫水0 天時，種子CAT 活性為22.07 U/g；2 天時，CAT 活性升至最高（24.40 U/g），之后快速下降；18 天時降至1.92 U/g，比0天時下降91.30%。

2.5 種子萌發與生理性狀的關系

種子含水率、萌發率、萌發指數、萌發歷期、根長、芽長及活力指數均與相對電導率和MDA含量呈極顯著負相關（P< 0.01），與CAT 活性呈極顯著正相關（P<0.01）（表1）。SOD 活性與9個萌發指標均無顯著相關性。

表1 狹葉坡壘種子萌發指標與生理指標的相關性Tab.1 Correlations among germination indexes and physiological indexes of H.chinensis seeds

3 討論與結論

狹葉坡壘種子初始含水率為42.57%，初始萌發率為90.00%。自然條件下，狹葉坡壘種子失水較快，隨種子含水率降低，種子萌發率逐漸降低；種子含水率高于34.67%時（自然脫水前4 天），種子萌發率、發芽勢和萌發指數降幅均較小；4天后，3個萌發指標下降速度較快，說明狹葉坡壘種子能忍受輕度脫水。狹葉坡壘種子自然脫水8 天時，種子含水率為31.21%，此時的種子萌發率為51.67%，接近半致死，說明狹葉坡壘種子壽命較短，8 天內若沒有適宜的萌發環境，種子極易失去活力，這可能是野外狹葉坡壘林下幼苗較少的原因之一。自然脫水16 天后，狹葉坡壘種子含水率降至22.80%，此時種子完全失去活力，與坡壘（Hopea hainanensis）[17]、多毛坡壘（Hopea mollissima）[13]和絨毛番龍眼（Pometia to?mentosa）[18]等熱帶雨林植物相似，符合頑拗性種子特性，且屬于高度頑拗性類型[19]，對脫水高度敏感。

相關研究表明，頑拗性種子含水率高，大多能迅速萌發，不存在休眠現象[20-21]。狹葉坡壘種子亦是如此，采收后2天可萌發，無休眠期。隨種子含水率降低，狹葉坡壘種子萌發時滯逐漸增加，與金絲李研究結果一致[4]，可能是脫水導致種子代謝遭到破壞，待自身修復后才能萌發，萌發啟動時間延長[22]。狹葉坡壘種子的活力指數、根長和芽長均隨脫水時間增加呈下降趨勢，與蒲葵（Livistona chinen?sis）種子類似[23]，與遼東櫟（Quercus wutaishansea）種子不同[21]，這可能是因為不同樹種種子的內源激素含量和酶活性有差異[24-25]。

相對電導率是衡量細胞膜透性的主要指標，其值越大，細胞電解質滲漏量越多，細胞膜受損程度越大[26]。丙二醛是細胞膜脂過氧化的終產物，會加劇細胞膜損傷，且具有改變細胞蛋白質結構和功能、降低抗氧化保護酶活性等毒性作用[4]。常用相對電導率和丙二醛含量衡量種子受害程度[4，27]。本研究中，隨種子含水率降低，狹葉坡壘種子相對電導率和丙二醛含量逐漸上升，與楨楠（Phoebe zhen?nan）[16]、蒲葵[23]和馬拉巴栗（Pachira glabra）[28]種子研究結果一致。相關分析表明，相對電導率和丙二醛含量與含水率、萌發率、萌發指數及活力指數均呈極顯著負相關，說明脫水導致的細胞膜損傷是狹葉坡壘種子劣變的主要原因。

相關研究表明，種子內抗氧化酶系統能在一定程度上抵御脫水引起的自由基及膜脂過氧化作用對細胞膜造成傷害[29-31]。本研究中，隨狹葉坡壘種子含水率逐漸降低，超氧化物歧化酶活性呈波動性升降，過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢。脫水前期（0～4天），種子過氧化氫酶活性比0天時升高，超氧化物歧化酶活性下降，說明過氧化氫酶先啟動，分解過氧化氫對種子的危害；此時，種子維持較高萌發率，說明狹葉坡壘種子脫水前期主要受過氧化氫危害，且過氧化氫酶能維持細胞膜完整性；期間，種子相對電導率和丙二醛含量基本保持平穩，也能說明這一點；過氧化氫酶是該時期的敏感性保護酶。隨脫水時間增加，過氧化氫酶活性快速下降，超氧化物歧化酶活性快速上升，至第10 天達到峰值，之后快速下降；種子相對電導率和丙二醛含量快速上升；種子萌發率快速下降；說明脫水導致種子內部產生大量自由基，對種子產生嚴重毒害；10天后，毒害超出種子耐受范圍，超氧化物歧化酶活性驟降，不能有效清除自由基，種子逐漸失活。在狹葉坡壘脫水后期，超氧化物歧化酶活性又出現升高趨勢，這一現象在金絲李種子脫水耐性研究中也存在[4]，具體原因有待進一步研究。

狹葉坡壘種子無休眠性狀，初始含水率和萌發率較高。隨種子含水率降低，種子相對電導率和丙二醛含量逐漸上升，細胞膜損傷導致種子發生劣變。脫水前期（0～4 天），種子通過提高過氧化氫酶活性維持細胞膜完整性，種子萌發率降幅較小。脫水4 ～ 10 天，細胞膜損傷加劇，種子萌發率快速下降，種子通過提高超氧化物歧化酶活性抵御毒害。脫水10 天后，毒害超出種子耐受范圍，種子逐漸失活。狹葉坡壘種子對脫水高度敏感，屬于高度頑拗性種子。了解頑拗性種子的脫水耐性生理和調控機制對其貯藏和保護有至關重要的作用。本研究雖然闡述了狹葉坡壘種子抗氧化系統與脫水耐性的關系，但對于種子脫水過程中水分和養分代謝、激素調控和調控候選基因和位點及其調控網絡等并不清楚。后續需對狹葉坡壘種子脫水耐性生理和調控機制進行深入研究，為其種質資源保存和保護提供更多科學依據。