香鱗毛蕨 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因的克隆及表達分析

蘇佳萌，袁 強，張冬瑞，湯 珣，常 纓

(東北農業大學 生命科學學院,哈爾濱 150030)

萜類化合物是一類具有不同結構和生物學功能的天然產物，由異戊二烯單元構成，多數屬于次級代謝物，在植物生長發育過程中的氧化還原反應、光吸收、生長調控等發揮著重要作用[1-2]。除此之外，萜類化合物可應用于化妝品、生物燃料、醫藥等領域，擁有巨大的經濟效益顯著[3-4]。萜類化合物的生物合成起始于兩種通用五碳前體，異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，二者可通過位于細胞質的甲羥戊酸途徑(MVA pathway)及質體中的甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP pathway)合成。一般倍半萜、三萜的前體(FPP)由MVA途徑合成，而MEP途徑則提供了單萜、二萜和四萜等化合物的前體物質(GPP、GGPP)[5-6]。

MEP途徑中，在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)催化下甘油醛-3-磷酸(GAP)與丙酮酸縮合形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，DXS合成酶作為限速酶控制著DXP的供應，從而對植物體內萜類化合物的合成產生影響[7]。目前已在多種植物中對DXS基因進行了克隆分析，如，構建長春花(Catharanthusroseus)CrDXS轉基因毛狀根使得萜類生物堿的積累量增加[8]，丹參(Salviamiltiorrhiza)毛狀根中過表達SmDXS2產生了比對照組水平更高的丹參酮[9]，桑樹(Morusnotabilis)MnDXS1的過表達轉基因株系開花時間早、GA積累增加[10]，煙草(Nicotianatabacum)中表達大豆(Glycinemax)GmDXS的轉基因株系葉綠素等光合作用色素含量顯著升高[11]。此外，過表達DXS基因可以間接提高植物的抗逆性，楊樹(Populustrichocarpa)幼苗在ABA、NaCl、10%聚乙二醇6000和H2O2處理下，PtDXS的表達增加，推測PtDXS能夠提高楊樹抗鹽、抗旱能力。非生物脅迫處理下的馬尾松(Pinusmassoniana)中也出現了相似的表達模式，表明PmDXS與馬尾松的抗逆性呈正相關[12-13]。

香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)屬于鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(Dryopteris)，為多年生蕨類，揉碎略有香味，故有香鱗毛蕨之稱，在中國以黑龍江省為主要生長區域[14-16]。香鱗毛蕨生境特殊，火山噴發后形成的熔巖臺地或巖漿縫隙中多見其生長。作為藥用植物其活性成分分離鑒定為萜類化合物、黃酮類化合物和間苯三酚類等。從香鱗毛蕨中提取得到的一種倍半萜Albicanol已被證明具有抗衰老和抗氧化活性，且香鱗毛蕨具有的抑菌活性與間苯三酚類物質相關[17-20]。

在香鱗毛蕨萜類代謝的研究中，已對其倍半萜，三萜合成途徑中的主要關鍵酶法尼基焦磷酸合酶DfFPPS、角鯊烯合酶DfSQS[21]基因進行了克隆及功能奠定?？紤]到MEP途徑在單萜、二萜合成的重要作用，本研究克隆得到了香鱗毛蕨2條DfDXS的cDNA全長，分別命名為DfDXS1和DfDXS2，對其進行生物信息學分析，并利用qRT-PCR檢測DfDXS基因不同脅迫處理下的表達模式，為深入研究香鱗毛蕨DfDXS基因的生物學功能奠定基礎，進一步了解香鱗毛蕨萜類化合物的合成機理，也為探索香鱗毛蕨的抗逆機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

植物材料采用的是人工快繁培育的香鱗毛蕨孢子體幼苗，培養溫度條件設置為22 ℃，相對濕度50%，光周期條件(光照/黑暗)為16 h/8 h[22]。

待香鱗毛蕨長至幼苗期時，用流水將幼苗葉片表面輕輕沖洗并吸干水分。激素處理實驗組分別對葉片噴灑100 μmol·L-1水楊酸(SA)、10 μmol·L-1脫落酸(ABA)、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)和500 μmol·L-1乙烯利(Eth)；非生物脅迫實驗組分別進行20%聚乙二醇(PEG)模擬干旱，200 mmol·L-1NaCl整株澆灌，42 ℃高溫 (HT)和4 ℃低溫(LT)處理，對照組噴施蒸餾水。所采取濃度為前期試驗得出。在處理0、0.5、1、3、6、12、24和48時分別取樣，樣品剪成1 cm小段裝袋，液氮速凍保存并放入-80 ℃的冰箱備用，每次樣品處理包含至少3次生物學重復。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成對實驗組及對照組的香鱗毛蕨孢子體葉片采用Trizol法提取獲得RNA(擎科，中國哈爾濱)，參考說明書進行。以總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒(諾唯贊，中國南京)，參照說明書進行cDNA合成。

1.2.2DfDXS基因克隆及生物信息學分析根據香鱗毛蕨轉錄組數據庫進行本地Blast篩選，獲得2條DfDXS基因，在NCBI網址中利用Blastp對其它物種的DXS蛋白氨基酸序列檢索，比對結果顯示出較高的相似性，于是分別將其命名為DfDXS1、DfDXS2。設計正、反向引物 (表1)，進行PCR擴增。PCR模板為反轉錄獲得的香鱗毛蕨cDNA，體系為模板cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq酶緩沖液10 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應程序設置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃15 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；4 ℃保溫。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并按照說明書純化回收特異性條帶，隨后連接到克隆載體pEASY-T18并轉化至DH5α感受態細胞中，經菌落及菌液PCR檢測后送往哈爾濱睿博生物技術有限公司測序。

表1 引物序列

通過ExPASy-ProtParamtool在線分析DfDXS氨基酸序列，獲得其組成成分及理化性質；利用在線軟件(表2)預測DfDXS蛋白結構、亞細胞定位及保守基序 (Motif)。

表2 生物信息學分析網址

運用NCBI的Blastp工具，檢索數據庫中DfDXS基因同其他植物的DXS基因的同源氨基酸序列，使用DNAMAN對下載的氨基酸序列進行同源比對。利用MEGA7.0 軟件繪制系統進化樹，采用鄰位相連算法(Neigh borjoining)分析DfDXS1、2與其他植物DXS的系統進化關系，Bootstrap值設置為1 000。

1.2.3DfDXS的表達分析使用PrimerPremier6.0軟件設計DfDXS基因的qRT-PCR特異引物，內參基因為Df18sRNA，所用引物序列詳見表1。qRT-PCR體系為SYBR Green熒光染料10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA1 μL，ddH2O補至20 μL，反應程序參考試劑說明書(諾唯贊，中國南京)。PCR反應系統為Mx-3000p Real-Time PCR System，采用2-ΔΔCt法計算DfDXS基因相對表達量，反應體系及程序參考試劑說明書，每個樣品重復3次。數據使用Excel 2016和DPS數據處理系統分析統計。引物為哈爾濱擎科生物技術有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 香鱗毛蕨DfDXS基因克隆及序列分析

根據實驗室香鱗毛蕨孢子體葉片的轉錄組數據，經Blastp找到2條DfDXS基因序列，分別命名為DfDXS1和DfDXS2，設計引物并進行目的基因擴增，發現在2 000 bp左右出現特異片段，與預期大小基本一致(圖1)。DfDXS1基因長2 139 bp，編碼712個氨基酸；DfDXS2基因長2 160 bp，編碼719個氨基酸。

M.DL2000；1.DfDXS1；2.DfDXS2

2.2 DfDXS蛋白質的理化性質及蛋白結構分析

經ExPASy在線軟件預測分析，DfDXS1蛋白質的相對分子質量為76.49 kD，DfDXS2蛋白質的相對分子質量為76.74 kD。理論等電點分別為6.64和6.62，是弱酸性蛋白；不穩定系數為89.92和90.00，屬于不穩定蛋白質；脂肪族系數為41.34和35.39，總平均親水系數為-0.050和-0.029，預測該蛋白是親水蛋白。利用Softberry 在線程序預測DfDXS蛋白亞細胞定位，結果顯示其位于葉綠體。保守結構域分析顯示DfDXS蛋白具有PLNO2582活性位點，為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的特征序列，證明香鱗毛蕨DfDXS蛋白結構完整。

使用NPS@ server在線預測DfDXS蛋白的二級結構發現，兩個蛋白質二級結構近似，均為alpha-beta型(圖2，A)。為進一步了解預測DfDXS的蛋白特性，使用SWISS-MODEL分析系統在線預測構建三維模型(圖2，B)，氨基酸序列相似性分別為82.62%和82.95%，低聚糖狀態下為同源二聚體。

A.二級結構；B.三級結構；藍色表示α-螺旋，紅色表示β-折疊，綠色表示β-轉角，紫色表示無規則卷曲

2.3 DfDXS蛋白質系統進化和序列比對及結構分析

通過Blastp對香鱗毛蕨DfDXS1和DfDXS2編碼氨基酸進行同源比對，并利用MEGA7.0軟件進行系統進化分析。結果表明，香鱗毛蕨DXS與銀杏(Ginkgobiloba)DXS、北美喬柏(Thujaplicata)DXS1、馬尾松(Pinusmassoniana)DXS1等聚在一支，親緣關系較近，與蒼術(Atractylodeslancea)等植物的DXS關系較遠(圖3)。

右側Motif 1-10表示香鱗毛蕨DfDXS基因編碼氨基酸的保守基序，Motif圖下方標尺表示蛋白長度

DNAMAN軟件進行多序列比對(圖4)顯示，DfDXS1、DfDXS2蛋白質與銀杏，北美喬柏、馬尾松、歐洲云杉和江南卷柏的DXS蛋白質相似性均在82%以上，與馬尾DXS1蛋白質的相似性達到86.69%。結構域分析顯示DfDXS1、2蛋白具有典型的轉酮醇酶保守域，包含焦磷酸硫胺素結合位點和轉酮醇酶結構域在內。

紅線為焦磷酸硫胺素結合位點，藍線為轉酮醇酶結構域

MEME在線網站進行Motif功能分析，DfDXS蛋白含有10個Motif，除Motif9外長度均為50 aa。Motif1、2中含有二磷酸硫胺結合位點(Transket_pyr)，Motif3、4、5、7、8與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXP_synthase_N)功能行使相關，Motif6、10含有轉酮酶C-末端結構域(Transketolase_C)，Motif9長度為46 aa，屬于Choline_bind_3，與膽堿結合相關。

2.4 激素處理下香鱗毛蕨DfDXS基因的表達

利用qRT-PCR分析外源激素SA、ABA、MeJA和Eth處理下香鱗毛蕨葉片中DfDXS的表達模式。結果(圖5)表明，SA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfDXS1、2表達總趨勢為先升高后降低，分別在處理1和3 h達到峰值，約為0 h的4.5和2.6倍。在ABA處理下，DfDXS1和DfDXS2的表達情況有所不同，DfDXS1除在1 h其相對表達量有所升高外，均低于0 h；DfDXS2則為下降趨勢。DfDXS1、2對MeJA 處理響應強烈，相對表達都表現為先升高后降低，且表達量顯著高于對照。值得注意的是，DfDXS2對MeJA的響應高且晚于DfDXS1。MeJA處理1 h時DfDXS1達到峰值，約為對照的6.7倍；DfDXS2于6 h時達到峰值，約為對照的12倍。Eth處理下，DfDXS1除3 h高于對照，其他時間點相對表達量低于對照；而DfDXS2相對表達量在Eth所有處理時間下均明顯下調且顯著低于對照。

處理內不同小寫字母表示處理時間之間在0.05水平存在顯著性差異，下同

2.5 非生物脅迫下香鱗毛蕨DfDXS基因的表達

在PEG、NaCl、高溫(HT)和低溫(LT)處理下，對香鱗毛蕨葉片中DfDXS表達進行qRT-PCR分析。結果如圖6所示，PEG模擬干旱處理，DfDXS1除3 h相對表達量略低于對照外，其他處理時間均高于對照，最高的表達量約為0 h的18.6倍；DfDXS2在1、3 h相對表達較低，其余處理時間均高于對照。DfDXS對NaCl模擬的鹽脅迫處理響應不明顯，在3 h時DfDXS1的表達水平略有上升，NaCl抑制DfDXS2基因的表達。高溫處理下，DfDXS1和DfDXS2均在0.5 h相對表達水平最高，分別為0 h的5和19倍，隨后表達量下降。低溫處理下DfDXS1和DfDXS2的相對表達水平呈先升高后降低的趨勢，1 h似乎是DfDXS面對冷脅迫的時間節點，相對表達水平驟降后提高。本研究結果顯示，非生物脅迫處理下DfDXS1和DfDXS2的表達水平產生了顯著變化，且DfDXS2對溫度變化的響應高于DfDXS1。

圖6 不同非生物脅迫處理香鱗毛蕨葉片中DfDXS1(A)和DfDXS2(B)的相對表達

3 討 論

DXS是MEP途徑下游產物的關鍵調控位點，在光合色素葉綠素和類胡蘿卜素的合成，植物抗病和抗逆等方面發揮著重要作用[23-25]。DXS基因家族已被廣泛研究，于多種植物中得到鑒定，但香鱗毛蕨DXS基因的生物學作用尚待研究。本研究克隆并鑒定了香鱗毛蕨中DfDXS1、DfDXS2，并對其進行生物信息學及表達模式分析。結構域分析顯示DfDXS蛋白具有典型且完整的轉酮醇酶保守域，證實DfDXS1、DfDXS2屬于香鱗毛蕨DXS基因家族。在線預測DfDXS蛋白亞細胞定位結果顯示其位于葉綠體，這與番茄(Lycopersiconesculentum)葉片DXS蛋白質的亞細胞定位結果一致[26]。根據已有報道，DXS基因家族根據功能可分為三個分支，Ⅰ型DXS主要作為管家基因，如參與葉綠素的合成；Ⅱ型DXS主要負責植物次生代謝產物的積累；Ⅲ型DXS在細胞中表達水平較低，主要參與含量水平較低的MEP途徑衍生物的合成[27]。綜合多序列比對和系統發育樹，DfDXS蛋白與馬尾松PmDXS1(UIB01902.1)、銀杏GbDXS1(AAS89341.1)相似性較高。因此DfDXS1、2可能屬Ⅰ型DXS，和葉綠素等光合作用涉及的萜類物質合成相關。激素和環境因子能夠影響植物DXS基因表達。實驗中外源噴施SA、ABA、MeJA、Eth四種激素，觀察香鱗毛蕨DXS基因的表達模式。在SA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfDXS1、DfDXS2相對表達量升高，分別在1 h和3 h達到峰值，隨后降低，這與煙草NtDXS2的表達模式相似[28]。SA是一種重要的信號分子，可以增強植物對生物性病原的抵抗作用。并有研究表明SA調控植物次生代謝物的生物合成，經SA處理24 h后的光果甘草三萜物質甘草酸苷的產量較對照組提高了4.1倍[29]。ABA被定義為一種逆境植物激素，ABA對DfDXS1、DfDXS2基因表達有一定的抑制作用，但在丹參毛狀根中ABA處理提高了DXS的轉錄水平[30]，說明DXS基因在不同植物不同部位行使著不同的功能。已有研究表明MeJA可提高萜類物質青蒿素含量及相關基因表達[31]，DfDXS對MeJA處理響應強烈，其相對表達水平顯著高于對照，這與銀杏GbDXS等對MeJA的表達模式相似[32]。DfDXS1對外源MeJA處理響應更快，DfDXS2的相對表達水平更高。關于DfDXS與外源激素和萜類合成三者之間的關系仍需要進一步探索。

干旱、鹽分和極端溫度等各種非生物壓力對植物的持續生長構成了威脅，植物對外界不同程度脅迫產生的防御作用同樣是影響萜類物質合成的主要因素[33-34]。有研究表明，MEP途徑可能有助于抵御干旱，利用其中間體和產物異戊二烯以某種方式緩解[35]。本研究中，在PEG模擬的干旱處理下香鱗毛蕨DfDXS的相對表達量總體上調，DfDXS1在12 h達到最高表達量約為0 h的18.6倍。然而水分虧缺狀態下的兩種番茄(Solanumchilense、Solanumlycopersicum)SlDXS的表達趨勢與此相反，干旱處理下的云杉(Piceaglauca) DXS活性也降低約50%[36-37]。這可能與香鱗毛蕨的特殊生境相關，長期進化下對干旱的耐受力增強。除此之外高溫、低溫對DfDXS誘導表達量上調，外界溫度變化1 h似乎是香鱗毛蕨DfDXS抵御逆境的時間節點，或許通過增加次生代謝產物的數量，從而抵御不良因素對香鱗毛蕨所造成的傷害，推測其在應激條件的調節中起重要作用[38-39]。對于DfDXS基因如何參與調控香鱗毛蕨抗逆等功能仍需進一步深入研究。

綜上，DfDXS1、DfDXS2對激素、溫度等脅迫處理的相對表達量呈現不同程度的變化，說明DfDXS可能在萜類物質合成與抗逆機制中發揮作用。這為后續進一步研究提高香鱗毛蕨萜類活性物質產量以及植物激素信號轉導途徑的響應機制奠定了基礎。