蔗茅EfMYB1基因的克隆與表達分析

饒席兵，錢禛鋒，張蓉瓊，何麗蓮,3，李富生,3*

(1 云南省作物生產與智慧農業重點實驗室，昆明 650201；2 云南農業大學 農學與生物技術學院，昆明 650201；3 云南農業大學 甘蔗研究所，昆明 650201)

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)貢獻了全球糖產量的80%，是一種重要的糖料作物[1]。甘蔗喜大水大肥，同時，其缺乏耐寒、抗旱等特性，加之中國的地形和氣候條件難以滿足甘蔗生長發育對水分、溫度和光照的需要，從而導致中國蔗區主要分布在廣西、云南、廣東等南方省市。因此，培育抗逆性強的甘蔗品種，擴大甘蔗種植區域，成為現階段甘蔗育種的主要方向。由于甘蔗栽培種不易開花，且與近緣物種的花期難遇，通過傳統的有性雜交方法難以實現品種性狀的定向改良，這些因素導致了甘蔗的育種工作進展十分緩慢[2]。蔗茅(Erianthusfulvus)是甘蔗的近緣野生種，在中國境內分布廣泛，具有較好的抗旱、耐寒、耐貧瘠、成熟早、高錘度等很多甘蔗栽培種不具備的優良特性，是改良甘蔗遺傳性狀十分重要的種質資源材料[3-4]。

基因轉錄有正調控和負調控之分，轉錄因子(transcription factor)是起正調控作用的反式作用因子。相關研究表明，轉錄因子通過特異性結合下游靶基因啟動子區域的順式作用元件從而調控靶基因的表達，使植物代謝和生理性狀方面發生特異改變以應對逆境脅迫[5-6]。研究發現主要參與調控植物逆境應答反應的轉錄因子家族有WRKY、NAC、ZFPs、MYB、和AP2/ERF等[7]。其中，MYB家族轉錄因子是數量較多，最為重要的轉錄因子之一，在調節植物次生代謝，參與信號傳導、生物與非生物脅迫應答以及激素反應等過程中扮演著十分重要的角色[8-11]。

研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)MYB轉錄因子超過198個[12]、水稻(OryzasativaL.)超過183個[13]。首個MYB轉錄因子于1982年在禽成髓細胞瘤病毒(AMV)中發現，并命名為v-MYB[14]。植物中第一個被發現的MYB轉錄因子基因是從玉米(ZeamaysL.)中克隆出來的ZmMYBCI，并發現該基因在花青素合成過程中起調控作用[15]。隨著組學、測序、轉基因和基因編輯技術的不斷發展，許多物種中的MYB家族轉錄因子已被鑒定，MYB轉錄因子的功能及其相關調控機理也逐漸被解析[16]。

低溫是限制植物生長、產量和分布的主要環境因子之一，MYB轉錄因子因其調控低溫應答關鍵轉錄因子CBFs表達，進而激活眾多下游冷應答基因CORs表達，被認為在植物冷脅迫應答反應中扮演著重要的角色[17]。在擬南芥[18]、大豆(Glycinemax)[19]、番茄(Solanumlycopersicum)[20]、水稻[21]、玉米[22]等植物中，眾多MYB基因能被低溫脅迫誘導而表達，進一步參與植物低溫應答網絡調控。然而，在甘蔗及其野生近緣種內，相關的研究一直鮮有報道。本研究通過結合蔗茅低溫脅迫下的轉錄組數據，利用RT-PCR等技術從蔗茅中克隆到EfMYB1基因，并對該基因與編碼蛋白進行生物信息學分析以及不同脅迫處理的基因表達差異分析，為豐富甘蔗育種候選基因庫和轉基因甘蔗育種提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

本研究涉及的試驗材料均來源于云南農業大學甘蔗研究所野生資源圃。用于低溫脅迫處理的材料為蔗茅99-1無性系，于溫室大棚內種植于花盆，對照組CK(0 h)于溫室大棚中正常生長，處理組(24 和72 h)待生長至5葉期時轉移至光量子通量密度為300 μmol·m-2· s-1，光周期為12 h/d，相對濕度為60%～70%，于低溫(4 ℃)光照培養箱中進行低溫脅迫處理。用于脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)脅迫處理的材料為蔗茅99-1無菌組培苗，處理組(6和12 h)用濃度為100 μmol/L ABA和MeJA溶液噴施整株，對照組CK(0 h)則噴施無菌水，于28 ℃、光強1 500～2 000 Lx、光周期12 h/d的條件下培養。以上處理均3次重復。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成在脅迫處理各時間點，分別取低溫脅迫處理的根(新生白根)、莖(中上段)、葉(+1葉)，ABA和MeJA脅迫處理的葉組織，置于液氮取回-80℃冰箱中保存。利用Tigen TrizolRNA提取試劑盒(天根，昆明)進行總RNA提取，提取的RNA于超凈工作臺下吹晾3 min，加入40 μL RNase-Free ddH2O進行溶解混勻。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，并用紫外分光光度儀進一步確定濃度。利用Fast Quant RT Super Mix快速反轉錄試劑盒(天根，昆明)將質量較好的RNA反轉錄成cDNA第一鏈備用。

1.2.2EfMYB1基因的引物設計與克隆利用 Primer 6.0 軟件，根據EfMYB1基因序列設計擴增引物(表1)。使用PrimeSTAR?GXL Premix酶(寶生物，昆明)，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：酶25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，DEPC處理水補足至50 μL。擴增程序為：98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，30個循環。PCR擴增程序結束后取5 μL PCR反應物進行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測，利用膠回收試劑盒(天根，昆明)進行目的片段回收純化，用pLB vector試劑盒(天根，昆明)連接至克隆載體。轉化至大腸桿菌DH5α感受態后于LB固體培養基上培養，然后進行菌落鑒定與測序分析。

表1 實驗所用引物

1.2.3EfMYB1基因的生物信息學分析使用ORF find、Conserved Domain Search在線網站預測EfMYB1基因的開放閱讀框(ORF)和保守結構域(CDD)。用 DNAMAN 6.0 軟件推導EfMYB1基因的氨基酸序列。利用SignaIP-3.0、TMHMM Server V2.0、Nephrons 2.0 Server分別預測編碼蛋白的信號肽、跨膜結構及磷酸化位點。蛋白二級結構用CFSSP在線軟件分析，三維結構建模用 SWISS-MODEL在線軟件預測。用MEGA7.0 進行EfMYB1蛋白多序列比對和系統發育樹構建。

1.2.4EfMYB1基因實時熒光定量表達分析使用 Primer 6 軟件根據EfMYB1基因開放閱讀框設計熒光定量引物MYB-F2、MYB-R2，選用肌動蛋白基因β-actin25S-F、β-actin25S-R作為內參基因引物(表1)。以低溫、ABA和MeJA脅迫處理反轉錄成的cDNA為模板，使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) SuperReal 熒光定量預混試劑增強版試劑盒(天根，昆明)，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行PCR反應，每個樣品設置3個重復。反應體系為：2×Real Star Green Fast Mixture with ROX 25 μL,正反向引物各1 μL，模板1 μL，DEPC處理水補足至50 μL。反應程序為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 RNA提取與EfMYB1基因克隆分析

利用凝膠成像系統觀察到提取出的RNA條帶清晰可見，沒有發生降解(圖1，A～D)。紫外分光光度計測得大多數RNA的OD260/280在1.8～2.0之間，表明RNA提取純度較高，幾乎沒有污染，可用于反轉錄后續試驗所需的cDNA。PCR擴增反應物經電泳檢測，發現大約在900 bp處有一條清晰的條帶(圖1，E)，經北京擎科生物公司測序得到1條長度為1 000 bp大小的序列，表明該基因已成功克隆。

M. DL2000; A(葉片)、B(根): 1～3. CK; 4～6. 24 h冷脅迫; 7～9. 72 h冷脅迫; C. 莖:1～4. CK; 5～8. 24 h冷脅迫; 9～12. 72 h冷脅迫; D.葉片:1～3. CK; 4～6. 6 h ABA脅迫; 7～9. 12 h ABA脅迫; 10～12. 6 h MeJA脅迫; 13～15.12 h MeJA脅迫; E. EfMYB1(1～2)

2.2 EfMYB1基因編碼蛋白生物信息學分析

將測序得到正確的EfMYB1基因序列在NCBI上進行開發閱讀框ORF預測，獲得一個全長759 bp的ORF，編碼251個氨基酸(圖2，A)。EfMYB1蛋白保守結構域預測發現，該蛋白具有一個較典型的SANT結構域，位于氨基酸序列的第18～70位。(圖2，B)EfMYB1蛋白親/疏水性分析發現，得分在0以下的區域占絕大部分，且親水性平均值為-0.73，說明該蛋白質屬于親水性蛋白。EfMYB1蛋白二級結構由51.59%無規卷曲、34.52%α螺旋和13.89%β折疊構成(圖3，B)，三級結構以無規則卷曲和α-螺旋為主(圖3，A)，與二級結構預測結果一致。蛋白質信號肽檢測結果顯示，該蛋白質無信號肽，屬于非分泌蛋白(圖3，C)。蛋白跨膜結構預測結果表明，該蛋白質不具備跨膜結構，屬于膜外蛋白(圖4，A)。磷酸化位點預測發現，ErMYB1多肽鏈中含有多個絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(>0.5)(圖4，B)，推測蛋白激酶易與該蛋白質作用。

A. 核酸及氨基酸序列; B. 保守結構域

A. 二級結構；B. 三維建模；C. 信號肽預測[Signal 0.5預測(真核)序列]

A. 跨膜結構預測; B. 磷酸化位點預測

2.3 EfMYB1同源蛋白比對及系統進化樹構建

為進一步了解該蛋白的功能和進化特征，通過NCBI蛋白數據庫搜索到與蔗茅EfMYB1蛋白序列相似的同源蛋白分別來自南荻(Miscanthuslutarioriparius)94.86%、高粱(Sorghumbicolor)92.22%、玉米(Zeamays)81.47%、寡花菊(Dichantheliumoligosanthes)79.91%、谷子(Setariaitalica)78.60%、黍(Panicummiliaceum)78.29%、疣粒稻(Oryzameyerianavar.granulata)62.45%、大麥(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)56.28%、節節麥(Aegilopstauschii)55.4%。多序列比對結果表明，蔗茅EfMYB蛋白與節節麥MYB蛋白的相似性最低，而與南荻MYB蛋白、高粱MYB蛋白的相似性最高(圖5)。進一步構建系統發育樹，結果顯示，蔗茅EfMYB與南荻MYB親緣關系最近(圖6)。

圖5 EfMYB1與其他物種蛋白序列比對結果

圖6 不同植物MYB蛋白系統進化樹

2.4 EfMYB1基因不同脅迫下的表達分析

分別以低溫、ABA、MeJA脅迫處理的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析，進一步分析EfMYB1基因在不同脅迫條件下的表達。結果(圖7，A)顯示，低溫脅迫不同時間，EfMYB1基因在根、莖、葉組織中的表達量不同。在根和葉組織中，EfMYB1基因的表達量隨低溫脅迫時間的持續逐漸上調；在莖組織中，低溫脅迫對EfMYB1基因的表達幾乎沒有影響。這說明該基因可能在蔗茅根和葉中發揮作用，進而參與蔗茅冷脅迫應答反應。

ABA與MeJA脅迫不同時間，EfMYB1基因的相對表達量也存在差異(圖7，B)。MeJA脅迫下，EfMYB1基因的相對表達量呈先升高后降低的趨勢，在處理6 h時達到最大值，且極顯著高于0 h。而脫落酸脅迫下該基因的表達水平極顯著低于0 h，表明蔗茅中該基因功能可能不依賴于脫落酸誘導。

A.低溫脅迫; B. ABA和MeJA脅迫；*和**分別表示同一組織(脅迫)不同處理時間基因表達差異達顯著 (P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)

3 討 論

經過漫長的自然選擇與進化，植物形成了其特有的調控機制，來適應環境中的種種危害。如通過一些抗逆基因發揮功能來調控植物生長發育的各個生理過程，而調控過程需要一些相關酶和調節蛋白的參與，MYB轉錄因子就屬于這種調節蛋白。MYB蛋白的活性與其磷酸化方式有關。相關研究表明，通過激酶對C端磷酸化可激活煙草NtMYB2基因的轉錄活性[23]。擬南芥ACC1蛋白經酪蛋白激酶2磷酸化后，可以提高與靶基因啟動子基因結合的能力[24]。本研究中克隆到的EfMYB1基因經生物信息學分析預測，發現該蛋白有多個磷酸化位點，因此，推測該MYB蛋白活性也可能和蛋白質磷酸化有關。

根據R結構個數不同，可將MYB轉錄因子分為1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB四個亞類。本研究得到的EfMYB1蛋白包含1個該家族典型的SANT結構域，推測屬于1R-MYB。相關研究表明，1R-MYB具有維持染色體結構的完整性和調節基因轉錄過程等作用[25]，故推測蔗茅EfMYB1基因也有類似功能。對編碼蛋白親疏水性預測時，發現得分數小于0的區域密集度明顯較高，結合親水性平均值分析，表明該蛋白質是一種親水性蛋白。進行跨膜結構預測時，沒有發現該編碼蛋白的跨膜結構，信號肽檢測結果顯示，該基因編碼蛋白沒有信號肽，說明蛋白的穩定性比較高，不易被降解。為進一步了解該EfMYB1蛋白的功能和進化特征，進行了蛋白多序列比對。結果表明蔗茅MYB蛋白與南荻MYB蛋白相似性最高，遺傳距離最近，表明該基因的功能可能與南荻中的同源基因功能相似。

Dong等[26]發現薔薇RmMYB108基因能被低溫脅迫誘導表達，在擬南芥中過表達該基因顯著提高了轉基因植物的耐寒性；持續低溫環境下，與野生型株系相比，轉基因株系表現更高的存活率和生長速率及更優的種子數量。Li等[27]發現玉米ZmMYB31基因的表達也受低溫脅迫誘導，過表達該基因能影響低溫響應基因的表達水平、轉基因株系的活性氧含量及光合強度等，從而賦予植物更強的低溫耐性。本研究在熒光定量表達分析時發現，低溫脅迫可以誘導EfMYB1基因在蔗茅根和葉組織中表達，且表達水平隨低溫脅迫時間的持續逐漸上調，故推測該基因屬于低溫脅迫誘導型表達基因，主要在蔗茅根組織和葉組織中行使功能，從而賦予蔗茅較強的耐寒性。

劉佳欣等[28]研究了不同激素處理對MYB基因表達的影響，發現ABA脅迫能誘導白樺MYB基因表達。而在本研究中，施加ABA脅迫后EfMYB1基因的相對表達量反而較CK降低，這可能是因為MYB基因的表達不依賴于ABA。 陸苗等[29]的研究表明，菘藍LiMYB34基因受MeJA顯著誘導，且在MeJA脅迫6 h時其相對表達量達到最大值，本研究得出的結果與該結果一致。

本研究通過結合蔗茅低溫脅迫下的轉錄組數據，首次從蔗茅中克隆到一個MYB基因，熒光定量PCR分析結果表明，該基因屬于低溫脅迫響應基因，可能參與蔗茅在低溫脅迫下的應答反應。本研究為深入解析蔗茅的耐寒機理及轉基因甘蔗育種提供理論基礎。