基于SSR分子標記的中國黃連木遺傳多樣性分析

任 重，白 倩，蘇淑釵*

(1 北京林業大學 林學院，省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京100083；2 北京林業大學，國家能源非糧生物質原料研發中心，北京 100083)

中國黃連木(PistaciachinensisBunge)是漆樹科黃連木屬落葉喬木，又名楷木、孔木、藥樹、茶樹、黃連茶、木黃連、雞冠木等。黃連木屬植物有阿月渾子(P.veraL.)、中國黃連木(P.chinensisBunge)和大西洋黃連木(P.atlanticaDesf)等20余種或變種[1]，中國有阿月渾子、中國黃連木、清香木3種[2]。

黃連木原產中國，分布很廣，在中國華北、華中、華南、西南、西北、中南地區27個省、市、自治區都有其資源分布。由于其適應性強、萌芽力好、耐干旱耐瘠薄等特點，在荒山綠化中被廣泛用作先鋒樹種[3]。21世紀以來，隨著生物質能源在全球內的迅速興起和發展，黃連木作為中國鄉土木本油料樹種，由于其可以全果榨油且果實含油率高、油脂品質好等獨特的優勢而被人們廣泛的重視和研究，成為中國首批確定重點發展的生物質能源樹種之一[4-5]。近年來，隨著各地區黃連木雌雄同株特異資源的相繼發現[6-7]，關于黃連木性別分化決定機制的相關研究也日漸深入[8-13]。此外，黃連木還在用材、藥用、觀賞和綠化等方面具有廣泛的利用價值[14]。多功能、多用途的利用價值，使得黃連木擁有著極為廣闊的發展空間。

分子標記技術是研究植物遺傳多樣性的重要手段，能夠有效揭示種內和種間的遺傳變異。SSR又被稱為微衛星標記，作為一種重復性好、多態性高、標記數量多、共顯性的分子標記，已經被廣泛的應用于基因定位及克隆、親緣分析或品種鑒定、農作物育種、進化研究及分子身份證構建等研究[15-17]。DNA分子身份證的構建是基于DNA指紋圖譜，運用多種編碼數字化處理電泳圖譜獲得字符串，并輔以條形碼或二維碼等科學表述[18]。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，熒光毛細管電泳提高了數據結果的準確性、減少了操作者的主觀實驗誤差、提高了檢測效率[19]。張雅楠等[20]利用14對EST-SSR分子標記，分析了額濟納濕地12個天然多枝檉柳種群的遺傳多樣性和遺傳結構，結果表明所調查的多枝檉柳種群遺傳變異信息豐富、遺傳多樣性較高、基因交流頻繁，且種群內的遺傳變異明顯高于種群間，種群間的遺傳距離與地理距離無相關性，為額濟納濕地多枝檉柳種質資源的管理、保護和利用提供了理論依據。陳小紅等[21]利用35個高基元SSR構建了來源于4個生態栽培區的130份黍稷種質資源的分子身份證。趙路寬等[22]利用SSR分子標記技術對99份甘薯品種材料間的親緣關系及遺傳結構進行探究，揭示了不同品種個體間的遺傳背景和基因滲透情況。

在黃連木的SSR分子標記相關研究中，吳志莊等[23]采用SSR分子標記技術對8個居群進行遺傳多樣性分析，揭示了黃連木天然居群在遺傳多樣性水平上的差異及遺傳分化狀況。郝麗娟[24]應用SSR分子標記技術對黃連木的遺傳距離與地理位置進行研究，結果表明遺傳距離在省份、經緯度方面基本趨于一致，二者存在密切的相關性。阮福娜等[25]應用SSR分子標記技術對140份黃連木樣本進行親緣關系和居群遺傳結構分析，結果表明在同一棵雌雄同株樹上，不同性別表現的花序，其SSR基因型是相同的，即花序性別類型的改變并未造成本身基因型的改變；而不同的株雌雄同株個體其SSR基因型是不同的。楊子玥[26]通過SSR分子標記技術鑒定雌雄同株黃連木子代的父本，選擇出雌雄同株黃連木適宜的授粉組合，提出了利用 DNA 親子鑒定確定適宜授粉組合的新方法。在黃連木的SSR分子標記相關研究中，存在使用引物質量較低、電泳結果分辨率不高以及取樣地范圍較小等問題，不能較為全面地反映全國分布的黃連木遺傳分化及遺傳多樣性等問題。因此，為了解黃連木在中國的分布狀態及不同地區種質資源的親緣關系，評估各地區種源間的遺傳多樣性和群體遺傳結構，實現分子層面的種質資源鑒定和保護，本研究在黃連木種質資源全國調查的基礎上，選取具有代表性的采樣區進行SSR分子標記試驗，利用毛細管電泳方法提高試驗準確性，并嘗試建立黃連木DNA分子身份證體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在黃連木全國分布區展開調查的基礎上，對其中20個省、市、自治區的29個黃連木分布區進行了調查收集(表1)，基于調查并初篩優質資源后進行采樣，供試材料分布廣泛且代表性強。每份材料采取若干幼嫩葉片，干燥處理后保存至-80 ℃超低溫冰箱備用。將29個黃連木居群按照其地理位置大致區劃為華北地區、華中地區、華東地區、秦巴山區、西南地區和東南沿海地區等6個區域。

表1 黃連木29個居群信息

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取黃連木基因組DNA的提取使用擎科植物基因組提取試劑盒，用紫外分光光度計(NANODROP 8000)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度和質量。檢測合格的DNA樣品稀釋至30 ng/μL置至-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴增體系聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR擴增采用20 μL體系：1 μL模板DNA(30 ng/μL)、10 μL 2×Taq PCR MIX、正、反引物各0.5 μL(10 μmol/L)、8 μL ddH2O補齊至20 μL體系。

熒光毛細管電泳PCR擴增采用20 μL體系：1 μL模板DNA(30 ng/μL)、10 μL 2×Taq PCR MIX、0.1 μL M13正引物(10 μmol/L)、0.3 μL反引物(10 μmol/L)、0.2 μL熒光標記(FAM，HEX，ROX 或 TAMRA)的M13引物、8.4 μL ddH2O補齊至20 μL體系。

反應程序均為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，51～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[27]。

1.2.3 引物篩選在阮福娜[28]所篩選的14對黃連木SSR引物及盧劍波等[29]公開發表的12對黃連木微衛星位點及引物專利基礎上，進一步通過非變性聚丙烯凝膠電泳試驗在全部26對引物中篩選出條帶清晰、重復性好、多態性高的引物用于全樣品的毛細管電泳分析。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2.4 毛細管電泳每次將4組不同熒光標記的PCR擴增產物混樣送測至上海生工生物工程技術有限公司進行毛細管電泳檢測。電泳結果使用Gene Marker v2.2.0軟件(Soft Genetics LLC，PA，USA)讀取等位變異片段大小信息。

1.2.5 數據統計分析使用 Power Marker V3.25[30]軟件對不同引物擴增的各樣品基因型數據統計主要等位基因頻率(MAF)、等位基因數(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因多樣性(GD)、Shannon’s多樣性指數(I)和多態信息含量(PIC)等信息。通過GenAlEx 6.502[31]計算種群間的遺傳分化固定指數(Fst)、主坐標分析(PCoA)和分子方差分析(AMOVA)，利用這些數據評估各種群間的遺傳分化和遺傳變異特征。

1.2.6 DNA分子身份證構建利用篩選出高質量SSR引物，對全部供試樣品進行熒光毛細管電泳，根據毛細管電泳結果來構建黃連木種質資源單株DNA分子身份證。將選用的SSR引物按照固定順序，每個樣品在對應的引物擴增出來的目的片段的大小按照引物順序直接編碼成字符串即為黃連木單株DNA分子身份證，再將單株種質資源的采樣地、編號及身份證號等信息導入二維碼生成器中即可得到二維碼形式的DNA分子身份證。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記引物對的篩選

利用部分樣品采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對全部的26對黃連木SSR分子標記引物對進行篩選(圖1)，共篩選出7對條帶清晰、多態性高、重復性好的高質量SSR引物(表2)，并將它們用于全部黃連木樣品的熒光毛細管電泳試驗。

表2 篩選出的7對SSR引物序列信息

M.DL500；1-25. KL007、KL008、KL009、KL010、KL011、KL012、KL013、LGC001、LGC002、LGC003、LGC004、MCC001、MCC002、MCC003、MCC004、WJC001、WJC002、WJC003、WJC004、WJC005、MAS001、MAS002、MAS003、MAS004、MAS005

2.2 SSR分子標記多態性分析

對選取的7對高質量SSR引物，利用熒光毛細管電泳方法對210份黃連木種質資源進行分析，部分樣品毛細管電泳結果見圖2。表3顯示，7對引物在210份種質中共擴增出158個等位基因位點，平均每對引物的等位基因數為22.571個。基因多樣性(GD)變化幅度為0.654～0.913，平均為0.804；期望雜合度(He)變化范圍0.257～0.771，平均為0.532；多態信息含量(PIC)變化范圍0.639～0.907，平均為0.784。7對引物的多態信息含量(PIC)均高于0.5，具有較高的多態性，可用于構建DNA分子身份證[32]。

表3 7對SSR引物的檢測數據

圖2 采用引物PC96對部分樣品的擴增結果

2.3 聚類分析

基于UPGAM方法對29個采樣地的210份黃連木資源進行聚類分析，結果(圖3)表明，全部采樣地被分為2個大類，西南地區的6個采樣點單獨聚為Ⅰ 類，其他地區采樣點聚為 Ⅱ 類，而其中東南沿海的4個采樣點在 Ⅱ 類里相對較為集中，聚集為一小類。

紅色為組群Ⅰ；藍色和綠色為組群Ⅱ；圖中采樣點“同表1”

2.4 群體間遺傳多樣性

黃連木作為中國的鄉土樹種，雖然在中國有著較為廣闊的分布空間，但并未形成較大的遺傳分化，也鮮有品種的馴化和審定。故本研究在全國較大范圍采樣的基礎上，參考聚類分析的結果，將采樣地根據中國的地理分區，大致區劃為6個群體分布區進行相關研究，分別為華北地區、華中地區、華東地區、秦巴山區、西南地區和東南沿海地區(圖4)。

圖4 黃連木中國的分布圖及采樣點信息

分析不同地區黃連木群體的遺傳多樣性數據可知(表4)，觀測雜合度(Ho)介于0.373～0.600之間，平均值為0.520；期望雜合度(He)介于0.632～0.811之間平均值為0.737；均高于0.500，表明黃連木在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。變異位點數(Na)、Shannon’s多樣性指數(I)均為秦巴山區>華東地區>西南地區>華北地區>華中地區>東南沿海地區。

表4 不同地區黃連木群體遺傳信息

2.5 群體遺傳分化與變異分布

Fst固定系數是反映群體等位基因雜合性水平、用于衡量種群分化程度的指標，其取值范圍在0～1之間。通過計算不同群體間的Fst固定系數可知(表5)，黃連木各地區群體間的遺傳分化值在0.015～0.099之間，并不存在較高的遺傳分化。其中西南地區與華北、華東地區，東南沿海地區與華北、華中、華東、西北、西南5個地區的黃連木群體遺傳分化值在0.05～0.15之間，表現出中等程度的遺傳分化。而其他各地區群體之間的遺傳分化值均小于0.05，表明這些區域間只存在較低的遺傳分化，具有較近的親緣關系。

表5 各地區群體間的Fst值

對各地區黃連木群體進行分子方差分析以確定群體間位點的變異總量及在群體間和群體內的變異分布(表6)。結果表明，群體間的變異占總變異量的6%，群體內的變異占總變異量的94%，變異主要發生在群體內，群體內的基因交流明顯大于群體間基因交流。

表6 各地區黃連木群體間的AMOVA分析

2.6 群體結構分析

通過對210份黃連木資源進行群體遺傳結構分析后發現，當K=2時，ΔK出現峰值(圖5)，將全部調查資源分為2個組群(圖6)，其中綠色組群Ⅰ主要為黃連木西南地區群體，而紅色組群Ⅱ則為其他5個調查區群體。可見黃連木群體分析結果與聚類分析結果也是相一致的，西南地區黃連木較全國其他地區黃連木有著相對較遠的親緣關系和相對較大的遺傳分化與變異，成為中國黃連木自然分布區內一個較為獨立的群體。

圖5 各群體黃連木群體結構分析的ΔK值分布

K=2時Structure分組結果，圖中同一顏色表示屬于同一分支；綠色代表pop5，紅色代表pop1、pop2、pop3、pop4和pop6

2.7 主坐標分析

對全部黃連木資源進行主坐標分析(PCoA)，結果可知(圖7)，全部資源除西南地區和東南沿海地區大致聚為相對集中的組群外，其他地區的黃連木資源相互摻雜、重疊較多，分組不明顯，共同聚集為一個大組。這一結果也與調查地區黃連木的聚類分析和群體分化與變異結果一致，同時也證明了中國黃連木暫未形成較大的遺傳分化，全國范圍內的黃連木種群均具有較近的親緣關系。

圖7 各群體黃連木主坐標分析圖(PCoA)

2.8 DNA分子身份證構建

對于選擇的7對高質量SSR引物，可將全部供試樣品區分開，故而可以用來構建DNA分子身份證。將選用的7對SSR引物按照CUPVD002、CUPVD117、ptms-3、PC19、PC64、PC96、PC106的固定順序，每個樣品在對應的7對引物擴增出來的目的片段的大小按照引物順序編碼成的字符串即為DNA分子身份證，在對應位置上，相同的代碼表示該引物在樣品中擴增出單個條帶。每對引物在樣品中擴增出的目的條帶大小均在110～400 bp之間，因此每對引物均為兩個3位數的字符串編碼，未擴增出條帶的則以兩個0編碼，最后以“g”終止，即為一個完整的分子身份證。最后將單株的采樣地、編號及身份證號等信息導入二維碼生成器中以得到二維碼DNA分子身份證進行科學保存。

以其中來自北京海淀地區編號為ZWS001的樣品為例，其在該體系下構建的分子身份證號為：267267174174158160262274180190190194228228g，表示該樣品在引物CUPVD002擴增條帶為267/267，在引物CUPVD117擴增條帶為174/174，在引物ptms-3擴增條帶為158/160，在引物PC19擴增條帶為262/274，在引物PC64擴增條帶為180/190，在引物PC96擴增條帶為190/194，在引物PC106擴增條帶為228/228，最后以“g”結束編號。下圖為部分樣品的DNA分子身份證二維碼(圖8)。

圖8 部分樣品DNA分子身份證二維碼

3 討 論

3.1 中國黃連木種質資源遺傳多樣性分析

遺傳多樣性水平是由進化歷史事件、分布區大小、生物學特性和生態條件以及人為干擾等因素綜合作用的結果[33]，黃連木在中國廣泛的分布區和古老的栽培史也使得其擁有著豐富的遺傳基礎。遺傳多樣性是生命進化和物種分化的基礎，任何一個物種或生物個體都蘊涵著大量的基因，它所包含的基因變異越豐富，對環境的適應能力就越強，進化的潛力也越大。作為一個極具開發潛力、兼具觀賞、綠化、藥用、油用的多功能樹種，關于黃連木遺傳多樣性的研究并不多。王超等[34]利用隨機擴增微衛星多態性(RAMP)對中國6個地區的180份黃連木樣品進行遺傳多樣性研究，結果表明群體內的基因分化較高，是變異的主要來源，群體間的基因流為1.7633，也表明各個群體間基因交流較為順暢。吳志莊[35]利用簡單重復序列(SSR)對8個黃連木天然種群遺傳多樣性進行研究，由遺傳距離將8個居群聚為3大類，各居群的遺傳多樣性處于中等水平。整體來看，近10年來中國關于黃連木遺傳多樣性的研究較少且涉及地域范圍不大，對黃連木種質資源的開發利用和保護工作仍有待進一步加強。

本研究利用7對高質量的黃連木SSR引物，采用熒光毛細管電泳方法，對中國29個采樣點的210株黃連木資源進行遺傳多樣性分析。7對引物共檢測到158個等位基因，平均每對引物有22.571個等位變異，明顯高于吳志莊和郝麗娟等使用聚丙烯凝膠電泳方法的檢測結果，說明利用SSR能檢測到黃連木豐富的遺傳變異。多態信息含量(PIC)變化范圍0.639～0.907，平均為0.784，表明供試材料具有較高的多態性，其原因可能是本研究在全國進行了大范圍的調查采樣。

在遺傳分化方面，本研究通過UPGMA聚類、PCoA分析和群體遺傳結構分析對黃連木種質資源進行劃分，3種分析方法得到的結果較為一致，210份種質被劃分為兩大類，西南地區群體單獨為一類，其他地區單獨為一大類。種群間遺傳分化值在0.015～0.099之間，表明黃連木各地區群體間存在中等以下程度的分化，西南地區和東南沿海地區黃連木群體與其他群體有相對較大的遺傳分化。這表明在全國范圍內中國黃連木親緣關系較近，不同群體間相似程度高，并未形成明顯的遺傳分化，這可能與黃連木在中國開發利用仍處于起步階段，無性繁育和人為選擇少、功能應用較為單一有關。此外分子方差分析(AMOVA)可知，黃連木各地區群體內的遺傳變異占94%，群體間的變異占6%，這說明黃連木群體間遺傳分化較小，遺傳分化主要存在于群體內，這也與管菊[36]和李琬婷等[37]在河南地區黃連木居群的研究結論較為一致。

在黃連木群體間遺傳多樣性方面，對不同地區黃連木群體間的關鍵遺傳數據分析可知，變異位點數(Na)、Shannon’s多樣性指數(I)均為秦巴山區>華東地區>西南地區>華北地區>華中地區>東南沿海地區，其中秦巴山區、華東地區、西南地區具有較高的遺傳多樣性，有利于黃連木優良品種的選育和遺傳改良。在較高遺傳多樣性的3個地區中，華東地區可能是由于采樣地包含合肥大蜀山植物園、上海辰山植物園、曲阜鼓樓北街行道樹等人工移栽苗木較多有關，存在不同群體間種源調撥的過程。秦巴山區黃連木群體的變異位點數(Na)、有效等位變異數(Ne)、Shannon’s多樣性指數(Ⅰ)均為各地區最高，是調查區遺傳多樣性最豐富的地區，其原因可能是四川廣元劍閣翠云廊自然保護區作為秦巴山區群體的主要采樣點，擁有著較為集中分布的黃連木古樹群落，進而使得該地區具有較高的遺傳多樣性。而與秦巴山區地理位置相鄰的西南地區也同樣表現出較高的遺傳多樣性水平，該地區的采樣點也多以天然古樹群落、散生古樹單株、黃連木天然林等為主。其聚類結果也單獨聚為一類，遺傳距離相對較遠，表明西南地區黃連木群體相對獨立且有極大可能為中國黃連木的起源所在，是黃連木種質資源遺傳多樣性和遺傳分化的核心區。

從大尺度群體進化角度看，秦巴地區和西南地區作為秦嶺南側，橫斷山脈北麓的中間區域，對植物的生存有著得天獨厚保障，也極有可能是第四紀冰川期重要的“植物避難所”。這也與中國近些年開展的第四紀冰期生物避難所的研究相契合。

第四紀冰期的低溫導致適應了溫帶和熱帶環境的物種遷移到避難所生長，成為它們新的生存中心。由于高大山脈的保護作用，秦巴山區獨特的地理條件緩沖了第四紀冰期冰川低溫對植物造成的破壞。再加上四川盆地、云貴高原和眾多河谷的良好水熱組合，形成了冰川時期的保護區，成為了亞熱帶植物區系擴散和分化的核心地區[38]。植物避難所具有獨特的地理條件、適宜的生存環境和豐富的生物資源，因此，植物避難所的確定也可以為生物多樣性保護區域的劃分提供依據，有助于生物多樣性的研究和有效保護[39]。研究黃連木種質資源的遺傳多樣性，對于探索其遺傳多樣性的豐富程度，掌握其特點和分布規律，促進黃連木種質資源的開發利用與保護、育種親本的合理選擇和優良基因的定位等方面都具有重要的意義[40]。

3.2 中國黃連木種質資源DNA分子身份證的構建

黃連木作為中國極具發展前景的優良鄉土樹種，其種質資源的調查與保護工作將為其未來的開發利用提供良好的基礎與支撐。DNA分子身份證作為一種直觀且方便快捷的種質資源鑒定方法，能有效地區分單株，是種質資源保護與開發利用的有力手段[41]。本研究利用篩選出的7對黃連木SSR引物，可將全部210份樣品鑒別出，形成唯一指紋圖譜，進而將DNA指紋數字化，得到每份材料的DNA分子身份證。由于其遺傳物質直接以DNA的形式表現，其差異體現的是不同的基因型差異，因而更加準確、客觀。在過往的研究中，雖然DNA分子身份證技術在諸多樹種中有廣泛的應用，但在黃連木的相關研究中卻鮮有報道，本研究利用等位基因賦值編碼方法，將每對引物擴增的等位基因按從小到大順序依次編碼，獲得每份資源的DNA分子身份證。借鑒DNA分子身份證技術，為黃連木種質資源“身份”的精準鑒定提供參考，也為其種質資源的收集、利用、和保護奠定基礎。

從公開發表的26對黃連木SSR引物中篩選出7對重復性好、多態性強、條帶清晰的引物進行黃連木遺傳多樣性分析，遺傳多樣性分析結果表明在全部采樣范圍內，秦巴山區、華東、西南地區黃連木遺傳多樣性較高。遺傳分化結果表明，全國范圍內黃連木遺傳分化不大且主要遺傳分化主要存在于群體內。用SSR分子標記結果創建了黃連木DNA分子身份證，為標準化管理黃連木種質資源提供參考。