白藜蘆醇通過促進活化T淋巴細胞凋亡改善小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎

陳藹如，沈 燕，羅 瓊，徐 強

(南京大學生命科學學院，醫藥生物技術國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

T淋巴細胞最初來源于骨髓，在胸腺發育并經歷陽性選擇和陰性選擇之后，成熟的T細胞來到外周淋巴器官。正常情況下，這些T淋巴細胞處于靜息狀態，一旦遇到“非己”抗原，便會迅速增殖進入炎癥部位發揮免疫功能。當外來物被清除的時候，為了維持免疫穩態，活化的T淋巴細胞必須立刻被清除，否則會引起自身免疫性疾病[1]。T淋巴細胞在沒有接收到相應共刺激信號，而T淋巴細胞受體(T cell receptor)又被再次刺激的時候，會通過Fas/FasL信號通路發生活化誘導的細胞死亡。這種調節機制可以避免效應T淋巴細胞過度表達產生的炎癥反應，維持外周的免疫耐受，同時還能保存記憶細胞[2]。人類多發性硬化(multiple sclerosis，MS)的患者體內就出現了這一機制的差異性表達：相較于健康人群，MS患者的Th1細胞對活化誘導的細胞死亡更加敏感，而Th17、Th1/17細胞則出現了抵抗[3]。因此，開發調控活化誘導的細胞死亡的藥物對自身免疫性疾病的治療有著積極作用。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學名為3，4’，5-三羥基-1，2-二苯基乙烯，是天然的多酚類植物抗毒素，也是非黃酮類植物雌激素[4]。Res在人們日常食用的果蔬(例如葡萄、花生、桑葚、大豆等)中大量存在，并且具有廣泛的藥理學活性，在抗氧化、抗炎、抑癌、免疫調節、神經保護等方面都有很好的效果[5]。本文重點考察Res促進活化T淋巴細胞凋亡發生的作用特點，并探討其分子機理，在此基礎上考察Res對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的治療效果。

1 材料

1.1 實驗動物健康C57BL/6J雌性小鼠，體質量18～20 g，6～8周齡，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司[生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養于南京大學生命科學學院動物實驗室，在(21±2) ℃、自由取食、自由飲水和12 h晝夜交替的SPF級條件下飼養。所有動物實驗均在南京大學實驗動物委員會的批準下進行，且實驗方法符合動物實驗的相關指南。

1.2 細胞株Jurkat細胞購于中國科學院細胞庫。

1.3 試劑Res(R5010)、Caspase Inhibitor VI(219007)、PMA(P8139)、離子霉素(Ionomycin)(I3909)、弗氏不完全佐劑(F5506)、百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)(P7208)購自MERCK；Purified anti-mouse CD3(145-2C11)、Purified anti-mouse CD28(37.51)購自BD；Mouse IL-2(P04351)購自R&D；Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒(40303ES20)購自翌圣生物；mouse CD4(L3T4)、MicroBeads(130-117-043)購自Miltenyi；結核分枝桿菌H37-Ra(Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra)(231141)購自Difco；MOG35-55凍干粉由生工合成；anti-PARP、anti-Caspase-3、anti-Cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；anti-Tubulin抗體購自Abmart。

1.4 儀器FACSCaliburTM流式細胞儀(BD)；垂直凝膠電泳儀、電泳槽、轉槽(Bio-Rad)；倒置顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 小鼠淋巴結細胞制備無菌摘取正常小鼠的腹股溝、腋下、頸部及腸系膜淋巴結置于盛有RPMI 1640培養基的培養皿中，用5 mL注射器針芯輕柔研磨將淋巴細胞擠出。反復吹打至細胞懸液均勻，通過篩網收集細胞懸液，300g離心5 min。棄上清后用RPMI 1640培養基洗滌1次，計數待用。

2.2 CD4+T淋巴細胞的純化小鼠CD4+T淋巴細胞純化按說明書進行。大致流程如下，取淋巴結細胞，離心并重懸于分選液中，每108個細胞加10 μL微珠。在4 ℃孵育30 min，每10 min震蕩1次。孵育完離心，用分選液重懸并計數，將細胞密度調整到1010L-1。使用2 mL分選液潤洗裝架的分選柱，每次500 μL，不能流干。潤洗完后，每次500 μL將細胞懸液過柱，然后用2 mL分選液洗柱子。待液體接近流盡時，一次性補加5 mL分選液。最后將分選柱從架子上取下，用注射器推至離心管中，即為純化的CD4+T淋巴細胞。將純化后的細胞進行FITC-CD4染色，流式細胞儀檢測細胞純度，純度大于95%。

2.3 細胞培養收集的淋巴結細胞、CD4+T淋巴細胞以及Jurkat細胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃、5% CO2培養。

2.4 活化誘導的細胞死亡模型將純化的小鼠CD4+T淋巴細胞與anti-CD3/CD28抗體(1 mg·L-1)孵育，培養72 h后，用新鮮無血清培養基洗2-3次，隨后置于含50 kU·L-1IL-2的完全培養基中靜息培養。靜息期間，在不同時間點分別加入Res共培養0、6、12、24、48 h。最后用anti-CD3抗體(1 mg·L-1)和IL-2(100 kU·L-1)再次刺激細胞6 h，誘導活化誘導的細胞死亡。Jurket細胞與Res共孵24 h，隨后用新鮮無血清培養基洗2～3次，再用100 μg·L-1PMA和1 mg·L-1離子霉素刺激24 h，誘導活化誘導的細胞死亡。

2.5 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗1遍，用1× Binding buffer重懸，先加入Annexin V-EGFP，避光孵育5 min，再加入PI Staining solution和適量PBS，上機檢測。

2.6 PI單染檢測細胞凋亡收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗1遍，加入PI Staining solution和適量PBS，上機檢測。

2.7 Western blot檢測蛋白表達水平收集細胞，提蛋白定量，沸水煮5 min后，經12.5% SDS-PAGE凝膠分離，濕法轉印至PVDF膜。PVDF膜在質量分數為5%的牛奶中封閉2 h后，加入一抗(一抗均1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日，用PBST洗3遍，再加入相應的二抗，室溫孵育2 h。PBST洗3遍后，用ECL發光液顯影。

2.8 小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型取MOG35-55凍干粉溶于PBS中(MOG：200 μg·只-1)；稱取結核分枝桿菌溶于IFA中(終濃度6 g·L-1)；將上述兩種混懸液按1 ∶1比例充分乳化成油包水狀態，制成誘導EAE的乳劑；采用多點注射法，于小鼠頸部及脊柱兩旁選3～4點皮下注射0.2 mL乳劑；同時尾靜脈注射百日咳毒素0.2 mL(含百日咳毒素 400 ng)；48 h后再次尾靜脈注射百日咳毒素0.2 mL。自免疫當天開始，每天給小鼠稱體質量，觀察，并進行神經功能評分。評分標注為通用的5級評分法：0分，不發病；1分，尾部無力；2分，尾部無力并且不完全后肢(1～2支后肢)癱瘓；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢和任一前肢均癱瘓，被動翻身后不能復位；5分，瀕死狀態或死亡。以質量分數為0.5%的羧甲基纖維素鈉為溶劑對照，給藥組小鼠每天灌胃給予100 mg·kg-1Res，給藥從免疫當天開始，持續至實驗結束。

平兒被停在窗前的一塊板上，用白布給他蒙住眼睛。隔院的人們都來看著，因為要曉得“鬼子”怎樣治病，“鬼子”治病究竟怎樣可怕。

3 結果

3.1 Res促進小鼠活化T淋巴細胞的凋亡將不同濃度的Res與na?ve T淋巴細胞或anti-CD3/CD28抗體活化的T淋巴細胞共孵24 h，Annexin V/PI雙染細胞后通過流式細胞儀檢測凋亡情況。如Fig 1A所示，Res可以劑量依賴性地誘導活化T淋巴細胞進入凋亡，并且大多數凋亡細胞進入晚期凋亡。當Res劑量為20 mg·L-1時，活化T淋巴細胞凋亡率達到0.55。但是，Res對非活化的T淋巴細胞則幾乎沒有影響(Fig 1B)。

3.2 Res促進T淋巴細胞活化誘導的細胞死亡體外利用純化的小鼠CD4+T淋巴細胞建立活化誘導的細胞死亡模型。PI單染結果(sub G1峰)顯示，與正常組相比，anti-CD3抗體再刺激導致細胞發生凋亡，而Res孵育則讓細胞對凋亡更加敏感，T淋巴細胞凋亡的強度和啟動速度都明顯高于對照組(Fig 2)。

此外，我們在Jurkat細胞上也建立了活化誘導的細胞死亡模型。Annexin V/PI雙染實驗顯示，PMA/離子霉素刺激誘導細胞進入早期凋亡，而Res孵育則劑量依賴性地促進早期凋亡進一步發生(Fig 3)。

3.3 Res通過Caspase通路促進活化誘導的細胞死亡為探討Res促進活化誘導細胞死亡的方式，我們檢測了Caspase 3和PARP的表達量。結果發現與Res共孵后，Jurkat細胞中剪切形式的Caspase 3和PARP增加(Fig 4A)，而這種增加可以被Caspase抑制劑逆轉(Fig 4B)。同時，Caspase抑制劑的預處理也明顯抑制了Res的促凋亡作用(Fig 4C)。

3.4 Res改善小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型EAE小鼠自d 11開始發病，發病率為37.5%，d 12就已超過50%，并在d 15達到100%，小鼠體質量也從模型發病時開始降低。自免疫當天起每天灌胃給予Res(100 mg·kg-1)干預，并考察其對小鼠EAE的影響，包括體質量變化以及臨床評分。如Fig 5A所示，給藥組小鼠盡管也從d 11開始發病，但發病率只有12.5%，d 14才達到50%；給藥組小鼠發病引起的體質量變化總體趨勢與模型組一致，雖差異無統計學意義，但從圖中可以看出較模型組相比更為緩和；給藥組小鼠的臨床評分從d 17開始明顯低于模型組(P<0.05)，并一直維持到d 20。HE染色結果表明，Res可以減少小鼠脊髓中炎性細胞的浸潤和“血管套”樣病變(Fig 5B)。

Fig 1 Dose-effect of Res on apoptosis in activated T lymphocytes (A) and na?ve T cells (B)

Fig 2 Effect of Res on activation-induced cell death of CD4+ T cells

Fig 3 Effect of Res on activation-induced cell death of Jurkat cells

Fig 4 Res enhanced Caspase signaling cascades

在模型進展高峰期(d 18)，收集溶劑對照組和給藥組小鼠的脾臟和引流淋巴結，分離純化CD4+T淋巴細胞進行體外培養，并加1 mg·L-1anti-CD3抗體再刺激24 h，檢測細胞的凋亡水平。結果表明，給藥組小鼠CD4+T細胞凋亡比例相較于溶劑對照組有所增加，但在anti-CD3抗體的誘導下，凋亡水平明顯升高，說明給藥組小鼠CD4+T淋巴細胞對活化誘導的細胞死亡更敏感(Fig 6)。

Fig 5 Res relieved development of

4 討論

我們的研究表明Res可以選擇性誘導活化T淋巴細胞凋亡，而對非活化T淋巴細胞沒有影響，同時還能讓T淋巴細胞對活化誘導的細胞死亡更加敏感。Res促進凋亡的機制與Caspase-3和PARP的剪切密切相關。Caspase-3在凋亡信號通路的終末端被剪切激活并發揮作用，其最主要的底物是PARP[10]。PARP是DNA損傷的感受器，參與DNA損傷修復，而在凋亡過程中，PARP被剪切失活，使細胞更加不穩定[11]。我們利用Caspase抑制劑發現Res的促凋亡效應被明顯逆轉。這樣的選擇性作用對于免疫性疾病的治療意義重大，因為免疫性疾病大多需要長期服藥，包括環孢素A、糖皮質激素在內的很多免疫抑制劑因其非選擇性作用常發生嚴重的毒副作用[12-13]。

Fig 6 Res promoted activation-induced cell death of CD4+ T lymphocytes in EAE

A:The apoptosis of CD4+T lymphocytes was measured by flow cytometry;B:Quantification of apoptosis level as in A.*P<0.05vsVehicle-treated-anti-CD3-;△P<0.05vsRes-treated-anti-CD3-;##P<0.01vsVehicle-treated-anti-CD3+.

此外，我們還在小鼠EAE模型上考察了Res對免疫性疾病的治療效果。MS是一種慢性自身免疫病，主要表現為中樞神經系統(central nervous system，CNS)白質炎性脫髓鞘病變[14]。炎癥反應在MS的發生和發展過程中起到了重要作用[15]，因為其發病機制主要由T細胞介導。T細胞首先被CNS的自身抗原活化，穿過血腦屏障激活小膠質細胞。這些細胞不僅可以直接損傷神經纖維周圍的髓鞘，還能誘導構成髓鞘的少突膠質細胞死亡[16]。EAE是目前研究MS的最佳動物模型。我們的研究表明口服Res可以明顯改善模型的各種癥狀，包括延緩小鼠發病時間、抑制模型嚴重程度、緩解由于小鼠發病引起的體質量下降，并能減少小鼠脊髓中炎性細胞的浸潤，同時給藥組小鼠也未見食欲匱乏、行動遲緩等癥狀，提示并不存在明顯副作用。此外，給藥組小鼠體內的CD4+T淋巴細胞對活化誘導的細胞死亡更加敏感。接下來，我們將從Caspase-3入手進一步探究Res誘導EAE小鼠中活化T淋巴細胞凋亡的分子機制。

綜上所述，Res可以通過激活Caspase-3選擇性促進活化T淋巴細胞凋亡，并使其對活化誘導的細胞死亡更敏感，同時在動物模型中也顯示出良好的治療效果。這不僅揭示了Res的作用特點，也提示選擇性促進活化的T淋巴細胞凋亡用于治療自身免疫疾病具有可行性。