去鐵胺、辛伐他汀治療大鼠慢性硬膜下血腫的研究

張士俊，吳煥成，王延民，李宏偉，胡群亮

（天津市北辰醫院神經外科，天津 300400）

慢性硬膜下血腫屬于一種較為常見的顱內出血性疾病，目前該病主要治療手段為鉆孔引流術，其能延長患者的生存時間，但術后復發率高達5.0%～30.0%[1]。核因子-κB 通過啟動和增強κB 位點的活化，使得腦損傷后出現繼發性損傷，與炎癥反應密切相關。辛伐他汀作為一種內源性膽固醇抑制劑，具有減輕腦水腫、改善微循環等作用[2]。去鐵胺作為一種鐵螯合劑，對鐵離子具有很強的親和力，能結合鐵蛋白或與含鐵血黃素結合的鐵，減少鐵在體內的病理性沉積，還可絡合游離的鐵，結合鐵蛋白或與含鐵血黃素結合的鐵。此外，去鐵胺也可滲透血腦屏障，降低腦出血后繼發的神經損傷，在局部腦組織中高濃度蓄積，降低血腫部位鐵離子的含量，從而發揮腦保護作用[3]。本研究主要分析去鐵胺、辛伐他汀治療大鼠慢性硬膜下血腫的效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究材料

清潔級6～8 周齡成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自北京維通利華公司，嚴格按照動物倫理要求進行實驗操作。所有SD 大鼠均飼養于清潔無菌級動物實驗中心，在標準的12 h 明/暗周期的清潔開放環境中飼養，動物房保持標準化的溫度濕度，每籠5 只，供應充足的氧氣。去鐵胺購自美國sigma 公司，辛伐他汀購自大量TAKARA 公司，Western blot 檢測試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒都購自上海生工公司，二甲苯、無水乙醇、3.0%雙氧水購自國藥集團。

1.2 方法

大鼠稱重后使用10.0%的水合氯醛腹腔注射麻醉（4 ml/kg），將大鼠俯臥位放置于大鼠腦立體定位儀上，保證大鼠的前囟和后囟處于同一穩定的水平面。切開大鼠頭部皮膚，暴露前囟和后囟，逐層分離皮下組織直至顱骨表面。固定微量注射器，以前囟為原點，在前囟前0.2 mm、中線右旁3.0 mm 鉆孔，硬腦膜下注入Ⅶ型膠原酶1 μl（0.2 U），調整注射速度為0.05 μl/min，注射完畢后留針10 min，無菌骨蠟封閉小孔并進行縫合。造模一周后經影像檢查血腫形成，將造模成功的大鼠（n=48）隨機平分為三組：模型組、辛伐他汀組、去鐵胺組，每組16 只。三組都在造模成功后2 h 經腹腔注射生理鹽水、2 mg/kg 辛伐他汀、50 mg/kg 去鐵胺各10 μl，之后每12 h 注射1 次，直至相應時間點處死。

1.3 觀察指標

①所有大鼠都在治療第5 d 與第10 d 進行前肢上抬實驗與前肢應用協調實驗，前者主要比較左側上肢成功上抬的百分比，后者評分為（右側-左側）/總觸壁次數×100.0%。②所有大鼠都在治療第10 d與第15 d 分別處死大鼠，測定血腫體積，斷頭取腦并固定，利用Image ProPlus 圖像分析軟件計算血腫體積。③所有大鼠都在治療第10 d 與第15 d進行靜脈取血500 μl，離心后取血清，采用酶聯免疫法檢測血清IL-6、TNF-α 含量。④取處死大鼠的血腫周圍組織，行Western Blot 檢測水通道蛋白（aquaporin，AQP）4、血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）蛋白表達水平，每孔蛋白上樣量20 μg，電泳、轉膜，室溫封閉2 h，然后加入一抗（1 ∶500）4 ℃孵育過夜；洗滌3次后，采用熒光二抗室溫搖床孵育1 h，洗滌3 次后將膜置于Odyssey 凝膠圖像處理系統進行曝光，計算VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平。

1.4 統計方法

采用SPSS 23.00 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組件比較采用單因素方差分析；計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組前肢上抬實驗與前肢應用協調實驗結果比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第5 d、第10 d 前肢上抬實驗值高于模型組，前肢應用協調實驗值低于模型組，且去鐵胺組前肢上抬實驗值高于辛伐他汀組，前肢應用協調實驗值低于辛伐他汀組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組治療不同時間點前肢上抬實驗與前肢應用協調實驗結果比較[（±s），%]

表1 三組治療不同時間點前肢上抬實驗與前肢應用協調實驗結果比較[（±s），%]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數 前肢上抬實驗 前肢應用協調實驗治療第5 d 治療第10 d 治療第5 d 治療第10 d模型組 16 52.59±2.83 52.59±3.11 29.48±3.22 29.40±3.09辛伐他汀組 16 58.29±3.11① 64.02±2.58① 26.98±2.48① 23.68±2.77①去鐵胺組 16 66.20±4.41①② 72.98±3.88①② 24.09±3.11①② 19.28±2.44①②F 值 13.203 17.933 10.003 12.485 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 各組血腫體積變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10d、第15d 血腫體積低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見表2。

表2 三組治療不同時間點血腫體積變化比較[（±s），μl]

表2 三組治療不同時間點血腫體積變化比較[（±s），μl]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 65.33±2.48 65.29±3.11辛伐他汀組 16 55.02±3.22① 45.98±2.58①去鐵胺組 16 40.59±5.18①② 34.58±2.86①②F 值 14.863 18.472 P 值 0.000 0.000

2.3 各組血清IL-6、TNF-α 含量變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d血清IL-6、TNF-α 含量低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見表3。

表3 三組治療不同時間點血清IL-6、TNF-α 含量比較[（±s），pg/ml]

表3 三組治療不同時間點血清IL-6、TNF-α 含量比較[（±s），pg/ml]

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數 IL-6 TNF-α治療第10 d 治療第15 d 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 34.33±2.18 34.98±3.14 45.58±2.19 45.78±2.22辛伐他汀組 16 15.69±1.38① 10.87±1.48① 23.77±3.18① 15.06±1.77①去鐵胺組 16 8.29±1.11①② 6.20±0.28①② 10.22±1.47①② 7.10±0.47①②F 值 25.013 33.203 27.014 34.156 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各組VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平變化比較

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d的VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），見表4。

表4 三組治療不同時間點VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平比較（±s）

表4 三組治療不同時間點VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平比較（±s）

注：與模型組比較，①P＜0.05；與辛伐他汀組比較，②P＜0.05

組別 例數 VEGF AQP4治療第10 d 治療第15 d 治療第10 d 治療第15 d模型組 16 4.59±0.32 4.57±0.24 5.10±0.27 5.13±0.18辛伐他汀組 16 2.77±0.23① 2.11±0.38① 3.17±0.22① 2.74±0.38①去鐵胺組 16 1.33±0.22①② 0.78±0.11①② 1.45±0.15①② 0.89±0.09①②F 值 19.373 22.477 18.766 21.094 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

3.1 去鐵胺可降低大鼠的血腫體積

本研究結果顯示，辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d 血腫體積低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明相對于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫能降低血腫體積。分析可知，他汀類藥物能降低血低密度脂蛋白膽固醇水平，改善血管內皮功能，抑制血管內皮炎癥反應，穩定粥樣斑塊，被廣泛用于心腦血管缺血性事件的一、二級預防。辛伐他汀是脂溶性他汀類藥物，血腦屏障通透率高，易在血腫腔及顱內聚集，對血管及炎癥的調節作用更強，更有利于血腫吸收及恢復[4]。而去鐵胺可通過降低游離鐵的羥自由基活性，催化血紅素的降解，增加血紅素加氧酶-1 的轉錄，防止羥基自由基的形成，并通過抑制谷氨酸介導的興奮性毒性來阻止血紅蛋白的神經毒性作用，有利于血腫的吸收[5]。

3.2 去鐵胺可改善大鼠的神經功能

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第5 d、第10 d 前肢上抬實驗值高于模型組，前肢應用協調實驗值低于模型組，且與去鐵胺組前肢上抬實驗值高于辛伐他汀組，前肢應用協調實驗值低于辛伐他汀組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明相對于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫可改善大鼠的神經功能。慢性硬膜下血腫是一個復雜的過程，包括溶血、炎癥因子大量釋放、補體級聯反應、氧化應激反應、腦血流量改變等。辛伐他汀上調內源性一氧化氮合酶，刺激一氧化氮合成，從而起到舒張血管、抑制平滑肌增生和血小板聚集的作用；抑制超氧化物的合成，阻礙血管平滑肌釋放氧自由基，降低氧化應激反應的神經毒性，進而保護神經功能[6]。而去鐵胺，一種自然產生的鐵螯合劑，參與維持腦鐵代謝，且大腦能產生鐵蛋白。鐵蛋白合成主要通過鐵或非鐵介導的轉錄后調節，而且腦內鐵蛋白水平上調可能參與神經保護，可減輕慢性硬膜下血腫后與血紅蛋白相關的腦水腫，抑制神經元死亡，可防治神經功能缺損和腦萎縮[7]。

3.3 去鐵胺可抑制大鼠血清IL-6、TNF-α 的表達

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10 d、第15 d血清IL-6、TNF-α 含量低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明相對于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫能抑制血清IL-6、TNF-α 的表達。慢性硬膜下血腫可誘發氧化應激反應與細胞毒性級聯反應，其中鐵超載為導致細胞功能障礙和預后不良的關鍵因素。促炎細胞因子可通過多種途徑參與慢性硬膜下血腫引起的炎癥反應，介導神經元壞死、缺失，是機體病理生理變化及繼發性炎癥損傷的重要環節。慢性硬膜下血腫可引起繼發性炎癥損傷，促炎因IL-6、TNF-α 在炎癥反應中起重要作用，IL-6、TNF-α 的表達調控機制對于制定慢性硬膜下血腫的防治策略具有重要意義[8]。辛伐他汀不僅可通過降血脂途徑發揮作用，而且還可通過改善血管內皮細胞功能、消炎等途徑，對腦血管疾病發揮一定的防治作用。辛伐他汀可通過抑制NF-κB 通路來降低IL-6、IL-8、TNF-α 表達，同時通過降低白細胞遷移、巨噬細胞浸潤等抑制炎癥反應，進而縮小腦梗死的體積，減輕炎癥損傷。而去鐵胺對離子鐵具有極高的特異性和親和力，能與離子鐵快速結合形成去鐵敏-鐵復合物，從而排出體外阻斷羥自由基的形成，具有清除腦組織氧自由基和激活缺氧反應基因等作用，可減輕慢性硬膜下血腫模型中相關鐵蛋白的表達，減輕腦內鐵超載現象，從而可以抑制神經元變性和細胞死亡，更加有效抑制炎癥因子的表達[8]。

3.4 去鐵胺可抑制大鼠的VEGF 與AQP4 蛋白的表達

辛伐他汀組、去鐵胺組治療第10d、第15d的VEGF 與AQP4 蛋白相對表達水平低于模型組，且去鐵胺組低于辛伐他汀組（P＜0.05），表明辛伐他汀、去鐵胺能夠促進神經功能恢復，有效調節患者炎癥以及血管生成，促進血腫吸收。慢性硬膜下血腫后腦組織VEGF 表達增加，后者可通過促分裂原活化蛋白激酶途徑上調AQP4 水平。AQP4 在神經系統分布廣泛，具有多種亞型，在體內水穩態調節中有著重要作用，與血腦屏障功能存在相關性。辛伐他汀可增強相關因子的表達活性，進而促進正常血管的增生以及病理性血管的修復及成熟，進而抑制VEGF 與AQP4 的表達。而去鐵胺可通過抑制小膠質細胞的活化和增殖，進一步減少神經炎癥，抑制自由基的產生，減輕神經細胞的凋亡，減少鐵離子在體內的病理性聚積，避免進一步加重腦損傷，從而有利于抑制VEGF 與AQP4 的表達[9]。

總之，相對于辛伐他汀，去鐵胺治療大鼠慢性硬膜下血腫既能抑制血清IL-6、TNF-α 的表達，也能抑制VEGF 與AQP4 蛋白的表達，從而降低血腫體積，改善神經功能。