微重力對擬南芥長勢影響的代謝網絡流平衡分析*

王芷涵 阮 耀 張青葉 張紅雨

(華中農業大學信息學院 武漢 430070)

0 引言

為保證長期空間任務的順利進行，必須有良好的生物再生生命保障系統（Bioregenative Life Support System, BLSS）。該系統能夠將代謝廢物變為可供利用的生物量，是人類長期空間生存的基礎[1]。在該系統中，高等植物起著關鍵作用。一方面，植物可通過光合作用合成人類生存所需營養物質，如糖類、脂類、蛋白質、膳食纖維和維生素等；另一方面，光合作用還可以消耗航天員呼吸產生的二氧化碳，生成氧氣，起到調節飛行器中二氧化碳與氧氣濃度平衡的作用。此外，高等植物還可以為密閉、狹小和嘈雜的空間在軌系統提供勃勃生機和活力，起到緩解航天員緊張情緒的作用[2]。因此，了解空間環境對植物生長發育的影響是研發BLSS 必不可少的工作。航天器中的微重力環境對植物而言是一種生長逆境，微重力會影響植物細胞分裂、細胞壁合成、胚胎發生、蛋白質、淀粉及脂肪酸代謝的調節、次生代謝物等植物生理生化特征的各個方面和生命活動的許多關鍵環節[3]。同時，在微重力條件下，植物可以節省在地面上必須維持重力的位置動態平衡而被消耗的能量，這可能會影響ATP 的產生[4]。

植物在微重力環境下可進行快速代謝反應，瞬時微重力環境下的擬南芥被觀察到對能量的需求增加，并改變了許多基因的轉錄水平，其中主要是與鈣離子和活性氧相關的基因[5]。在長期的微重力條件下，植物會通過代謝變化適應環境的改變。在空間飛行14 天后，擬南芥愈傷組織中有關碳水化合物代謝途徑的酶表達水平被觀察到較大的上調，說明擬南芥借此保證處于微重力環境期間的細胞能量供應[6]。微重力除改變植物的能量代謝之外，還影響著植物的轉錄后翻譯、細胞壁合成、生長素的運輸以及抗氧化防御等過程[7]。

微重力環境對植物的影響是多方面的，而代謝分析是能夠較為全面反映細胞過程的研究手段。作為系統級的生物網絡分析方法，基因組規模的代謝網絡（Genome-scale Metabolic Network Model）可根據化學計量平衡原理，基于基因－蛋白－反應三者關聯，以化學計量矩陣的形式對包含細胞內部發生的全部已知生化反應建立數學模型，然后使用約束重建和分析 (COBRA) 方法[8]對模型進行約束分析，模擬生物體的代謝狀態。同時，代謝網絡還允許將不同的組學信息整合到網絡中，建立特異性代謝模型，提高模型預測的準確性[9]。目前已測量了空間環境下擬南芥等高等植物的基因表達數據[10,11]，本研究擬將基因表達數據整合到代謝網絡中，構建地面環境和微重力環境下擬南芥的特異性代謝網絡，結合流平衡分析（Flux Balance Analysis, FBA）等代謝網絡優化算法，獲得地面和微重力環境下擬南芥的代謝狀態，研究微重力環境對植物代謝過程的影響機制。

1 材料與方法

1.1 基因表達數據

擬南芥的基因表達數據從GEO 數據庫下載，注冊號分別為GSE56658[10]，GSE56659[11]。二者均為STS-131 任務期間在空間中培育的擬南芥基因芯片數據，控制變量為微重力大小。前者是在BRIC-16 飛行試驗繞地飛行近13 天后測量的未分化的擬南芥細胞和擬南芥黃化幼苗的基因芯片數據。其中，空間飛行與地面控制條件各6 個樣品，共24 組數據，這里選取其中擬南芥黃化幼苗的基因芯片數據進行分析。后者是TAGES 飛行試驗期間，在國際空間站（ISS）生長了12 天后測量的擬南芥幼苗的芽、根、下胚軸以及整個植株的基因芯片數據，并使用相同條件在地面做了對比試驗。全植株重復3 組，芽、根、下胚軸各重復5 組，共36 組數據。

為研究擬南芥黃化幼苗、幼苗以及擬南芥不同器官組織對微重力的代謝響應，收集整理了擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸在微重力和地面環境下的轉錄組數據。在R（版本3.6.2）中使用R 包GEOquery（版本2.54.1）從GEO 數據庫下載基因芯片數據，使用R 包affy（版本1.64.0）、affydata（版本1.34.0）和limma（版本3.42.2）對數據進行質控，使用RMA 方法[12]進行芯片數據標準化，參數設置為默認。為了將基因表達數據整合到代謝網絡中，需將探針名稱替換為代謝模型中的基因名。由于存在多個探針對應同一個基因的情況，對存在多個表達值的基因，為將其整合到代謝網絡中并使其最接近真實轉錄值，將重復基因表達數據的均值作為網絡的約束。

1.2 基因組規模代謝網絡模型

AraGEM[13]是基因組規模的擬南芥代謝網絡模型。該模型主要涵蓋擬南芥的初級代謝，還包括了一部分次級代謝，共1601 個反應、1737 個代謝產物和4833 個基因－酶－反應的關聯，并根據亞細胞定位分為膠質細胞、線粒體、質體和過氧化物酶體。該模型包含預設的約束條件，為將基因表達信息作為約束整合到代謝網絡中，這里使用移除這些約束條件后的模型[14]。

1.3 基因表達數據約束代謝網絡模型

利用代謝網絡分析工具COBRApy[15]將基因表達數據整合到代謝網絡中。已開發Python 庫 py-TARG[16]**https://github.com/SergioBordel/pyTARG，通過對模型中所有反應施加最大邊界，實現自動約束人類全基因組代謝網絡。該方法允許計算代謝通量分布并評估限制酶催化反應速率的結果。因此，已被用于識別癌細胞系的代謝藥物靶點[17]。該方法基于基因－蛋白－反應的關聯規則，把基因表達數據作為模型中該基因對應反應的上限約束。為避免求解線性規劃時的數值問題，按常規的處理方式取基因表達值的10 倍整數[17]作為該基因對應反應的上限。分別將擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根和下胚軸在空間微重力與地面條件下的基因表達數據整合到擬南芥代謝網絡模型AraGEM 中，得到不同植株和組織處于微重力環境和地面環境下的特異性擬南芥代謝網絡模型。

1.4 流平衡分析

流平衡分析（Flux Balance Analysis，FBA）[18]是一個基于約束的模擬方法，通過計算代謝物通過該代謝網絡的通量，預測生物體的生長速率或代謝物的產生速率。流平衡分析將代謝物與反應的關系表示為化學計量矩陣，求解由約束和目標函數組成的線性規劃問題，得到目標函數的最優解和整個網絡的代謝通量分布。在數學上，FBA 可表示為

其中，Z是代謝網絡的目標函數，通常為最大化生物質產量，S代表化學計量矩陣，v表示反應通量，vlower和vupper分別為反應的下限和上限。等式約束確保了模型中代謝物產生的總量及其消耗的總量在穩態時是相等的，不等式約束規定了代謝反應的不可逆性以及允許的最大和最小通量。

這里以生物量為目標函數，計算擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸在空間微重力與地面條件下的生物質產量、ATP 產量和代謝通量分布，并計算了生物質產量和ATP 產量的下降率，下降率為負值時代表產量上升。生物質產量代表擬南芥長勢，生物質產量越高說明擬南芥長勢越好。

1.5 KEGG 富集分析

為進一步研究微重力環境影響擬南芥代謝狀態的生理機制，在流平衡分析得到擬南芥的生物質產量和代謝通量分布后，微重力與地面環境下擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸的差異代謝反應所對應的基因被提交到DAVID 數據庫[19]中進行KEGG 富集分析。KEGG 富集分析是生物信息研究中常用的方法，常用于研究測序數據中得到的一系列基因屬于哪些通路。常用的富集分析由超幾何分布計算，其數學表達式如下：其中，N代表總樣本數；M代表總樣本中特定類別的數量；n代表從總樣本中隨機抽取的數量；k代表抽取樣本中屬于特定類別的數量；p表示當原假設為真時得到的樣本觀察結果或更極端結果出現的概率，p值越小說明得到的結果越具有顯著性，這里選擇p值小于0.01 的通路作為富集結果。

2 結果

2.1 生物質產量以及ATP 相關反應的通量分析

對擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸對應樣本的基因表達值取平均，分別整合到擬南芥代謝網絡模型AraGEM 中，得到擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸的特異性代謝模型，利用流平衡分析得到其在微重力與地面環境下的生物質產量和代謝物產量。除了生物質外，ATP 的產量也被用來比較擬南芥的生長水平。在擬南芥的基因組規模代謝模型中，REner01_p 是葉綠體中產生ATP 的整體反應，RN04_m 是線粒體中NADH 呼吸鏈的ATP 反應產量，RN05_m 是線粒體中FADH 呼吸鏈的ATP 反應產量。

圖1 為基于擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸的代謝網絡預測得到的生物質及葉綠體、線粒體NADH 呼吸鏈和FADH 呼吸鏈的ATP 產量，微重力環境下擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根、下胚軸的生物質產量對比地面環境組均有所下降，分別下降了33.00%，51.52%，6.89%，12.53% 和11.70%。由于幼苗的葉綠體數量大于任何局部組織，擬南芥幼苗葉綠體的ATP 產量最高。作為葉綠體的主要分布部位，芽葉綠體的ATP 產量略低于幼苗。根與下胚軸不存在葉綠體，整合其轉錄組數據的擬南芥代謝模型葉綠體的ATP 產量位于同一水平，大大低于幼苗和芽葉綠體的ATP 產量。同時，由于擬南芥黃化幼苗葉綠體的生物發生受到抑制[20]，擬南芥黃化幼苗葉綠體的ATP 產量遠低于擬南芥幼苗。已有研究證明，微重力會使植物的葉綠素含量降低[21]，因此微重力環境下擬南芥幼苗葉綠體的ATP 產量相比地面環境的下降程度遠大于擬南芥黃化幼苗，微重力環境對擬南芥黃化幼苗葉綠體的ATP 產量影響相對更小。而微重力對線粒體電子傳遞鏈在擬南芥黃化幼苗、擬南芥幼苗以及擬南芥的芽、根、下胚軸中的影響大不相同，相比地面環境，擬南芥幼苗和黃化幼苗線粒體中FDAH 呼吸鏈在空間環境下的ATP 產量均有所提高，這可能是由于擬南芥節省了在地面上必須維持重力的位置動態平衡而消耗掉的能量，而根與下胚軸的情況卻與之相反，這可能是由于擬南芥的根與下胚軸相對其他部位來說受到了更大、更復雜的微重力環境影響，根系在微重力環境和地面環境下表型相差不大的擬南芥應該更適應空間環境。從整個植株來看，雖然微重力條件下擬南芥黃化幼苗和幼苗的生物質產量均大幅度下降，但相比擬南芥幼苗，擬南芥黃化幼苗的生物質產量的降幅更小，因此擬南芥黃化幼苗更適應空間微重力環境，選擇擬南芥黃化幼苗以及根與下胚軸短小的幼苗可能對構建生命保障系統更有幫助。

圖1 擬南芥黃化幼苗(a)、幼苗(b)、芽(c)、根(d)和下胚軸(e)在微重力與地面環境下的生物質產量以及ATP 相關反應的通量對比Fig. 1 Mustard biomass production and ATP synthesis reaction fluxes of Arabidopsis thaliana etiolated seedlings(a), seedlings (b), shoots (c), roots (d), and hypocotyls (e) in microgravity and ground environment

目前已有研究表明，空間微重力條件下生長的擬南芥幼苗比地面生長的擬南芥幼苗矮小，在空間微重力條件下生長的瓦斯萊型（Ws）和哥倫比亞型（Col）型擬南芥比地面條件下短約3 mm[22]。從擬南芥各植株或組織來看，微重力環境對擬南芥根的長勢影響最大，目前已有文獻表明，相比地面條件，空間微重力條件下擬南芥的生長速度更慢。在空間微重力條件下Ws 型和Col 型擬南芥均表現出較短的芽和根；對于根，空間條件下生長的Ws 型擬南芥平均比地面條件下生長的擬南芥短5 mm，而Col 型擬南芥平均短14 mm[22]。

2.2 KEGG 富集分析

為了研究微重力與地面環境不同導致擬南芥生長差異的生理機制，需進一步比較兩種環境中的主要差異代謝反應。由于大部分差異反應位于細胞質中，對位于細胞質上下調反應的相關基因進行KEGG 富集分析。

表1～5 分別是相對于地面環境、微重力環境中的擬南芥黃化幼苗、幼苗、芽、根和下胚軸下調反應對應的基因以0.01 為p值的閾值富集到最顯著的10 個KEGG 通路。碳代謝、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成，光合生物中的碳固定，抗生素的生物合成，氨基酸的生物合成途徑均出現在擬南芥黃化幼苗、擬南芥幼苗，擬南芥芽、根、下胚軸的富集結果中；乙醛酸和二羧酸酯代謝，丙酮酸代謝，檸檬酸鹽循環（TCA 循環），精氨酸生物合成，氮素代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑同時出現在擬南芥黃化幼苗和擬南芥幼苗的富集結果中；磷酸戊糖途徑、糖酵解、果糖和甘露糖代謝、酪氨酸代謝同時出現在擬南芥芽、根、下胚軸的富集結果中，結果表明下調的通路在擬南芥黃化幼苗、幼苗和各器官組織中具有較高的一致性，即微重力環境對植物及植物不同部位的不利影響是相似的。詳細結果列于表1～5。

相比地面環境，表6～9 分別列出了微重力環境中的擬南芥黃化幼苗、幼苗、根和下胚軸上調反應對應的基因被顯著富集到的前10 個KEGG 功能通路。表10 是擬南芥芽上調反應對應的基因顯著富集到的通路，相比擬南芥黃化幼苗、幼苗和其他器官組織，上調反應對應的基因富集到的通路較少，p值大于0.01 的通路僅有5 個，主要包含氧化磷酸化、吞噬體和抗壞血酸代謝等相關的代謝通路，說明擬南芥芽主要通過上調這些通路以應對微重力環境。而碳代謝、抗生素的生物合成、磷酸戊糖途徑、光合生物中的碳固定、氨基酸的生物合成和糖酵解出現在擬南芥黃化幼苗和擬南芥幼苗的富集結果中，沒有同時出現在擬南芥黃化幼苗，擬南芥幼苗，擬南芥芽、根、下胚軸的代謝途徑，可能跟擬南芥芽的上調富集結果過少有關，這也說明相對于下調的通路，擬南芥黃化幼苗、幼苗和各器官組織上調通路的不一致性更高，即植物及植物不同部位采取不同策略應對微重力的影響。

表1 擬南芥黃化幼苗下調反應對應基因的富集途徑Table 1 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana etiolated seedlings down-regulation reactions

表6 擬南芥黃化幼苗上調反應對應基因的富集途徑Table 6 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana etiolated seedlings up-regulation reactions

表10 擬南芥芽上調反應對應基因的富集途徑Table 10 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana shoot up-regulation reactions

表2 擬南芥幼苗下調反應對應基因的富集途徑Table 2 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana seedlings down-regulation reactions

同時，富集結果表明，部分上調和下調反應對應的基因同時富集到同一通路中，例如檸檬酸循環出現在擬南芥幼苗的上調和下調反應的富集結果中，糖酵解出現在擬南芥根的上調和下調的富集結果中，說明這些通路在微重力環境下的代謝調控機制更加復雜。

檸檬酸循環是活細胞將有機物完全氧化為二氧化碳和水的主要途徑之一。該循環提供了生命體活動的大部分能量，還提供了氨基酸、葡萄糖等合成所需的多種中間體[23]。分析擬南芥幼苗的上下調反應，發現微重力會下調擬南芥幼苗中檸檬酸循環過程中蘋果酸生成草酰乙酸的反應和琥珀酸生成延胡索酸的反應，而上調檸檬酸生成草酰乙酸的反應。

表3 擬南芥芽下調反應對應基因的富集途徑Table 3 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana shoot down-regulation reactions

表4 擬南芥根下調反應對應基因的富集途徑Table 4 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana root down-regulation reactions

糖類最主要的生理功能是為機體提供生命活動需要的能量，糖酵解是所有生物體進行葡萄糖分解代謝必須經過的共同階段。分析擬南芥根的上下調反應，發現微重力會下調β-葡萄糖的磷酸化反應和二磷酸果糖生成磷酸果糖的反應，上調α-葡萄糖磷酸化的反應。此前的研究也表明，糖酵解中氨基酸和糖代謝的異常會導致根發育的停滯[24]。

根據富集結果，光合作用中的碳固定通路被下調的情況也被發現。光合作用是綠色植物捕獲光能并把二氧化碳和水合成有機物同時釋放氧氣的過程。其主要包括光反應、暗反應兩個階段，涉及光吸收、電子傳遞、光合磷酸化、碳同化等重要反應步驟。同時，光合作用是植物將無機物轉換為人體能利用的有機物的重要途徑，是長期空間任務中生物再生生命保障系統中不可缺少的組成部分。已有的研究證明，微重力會對植物的光合作用產生影響。例如在微重力環境中生長的小球藻類囊體膜堆積會減少，葉綠素和類胡蘿卜素的含量減少35%～50%[25]；在空間種植的豌豆和擬南芥中也觀察到葉綠體中類囊體膜的結構變化[26,27]；在空間生長的小麥也被觀察到具有較低的光合速率[28]；甘藍型油菜植物在空間中的光化學活性降低30%等[29]。在本研究中同樣觀察到光合作用中用于碳固定通路被下調的情況，這可能說明微重力條件下擬南芥生長水平的下降可能是光合作用水平下降造成的。

表5 擬南芥下胚軸下調反應對應基因的富集途徑Table 5 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana hypocotyl down-regulation reactions

3 討論

利用特異性代謝網絡和流平衡分析研究了微重力環境對擬南芥長勢的影響以及其可能的生理機制。流平衡分析結果表明微重力環境會影響擬南芥生物質的合成和ATP 的產生，導致擬南芥幼苗、黃化幼苗、根、芽和下胚軸的生長水平比地面偏低，這與實驗結果一致[22]。但是，擬南芥黃化幼苗相比正常幼苗，在微重力環境下生物質產量下降的程度較低，因此黃化幼苗可能更能適應微重力環境。

表7 擬南芥幼苗上調反應對應基因的富集途徑Table 7 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana seedlings up-regulation reactions

表8 擬南芥下胚軸上調反應對應基因的富集途徑Table 8 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana hypocotyl up-regulation reactions

表9 擬南芥根上調反應對應基因的富集途徑Table 9 Enrichment pathways for genes corresponding to Arabidopsis thaliana root up-regulation reactions

擬南芥在微重力環境影響下的上下調代謝反應對應基因的KEGG 富集分析結果表明，微重力環境會影響擬南芥的多個代謝途徑，并且導致擬南芥光合作用中碳固定通路的下調，這說明擬南芥生長水平的下降可能是由于光合作用水平下降造成的，這與已有的研究結果一致[25–29]。同時，擬南芥不同組織共同改變的代謝途徑也可能為進一步的研究提供方向。

此前微重力環境對植物影響的研究多基于蛋白組或基因組，隨著測序技術的發展，轉錄組數據相對容易獲得，并且整合轉錄組數據的代謝網絡可以系統研究植物在微重力條件下的代謝變化。研究表明，代謝網絡模擬結果與實驗觀察結果有很高的一致性，并能夠對實驗結果進行機制解釋。

4 結論

近年來，隨著人類對空間探索的不斷深入，空間長期生存所需的生物再生式生命保障系統成為空間生物學的研究熱點。植物是該保障系統的關鍵要素，研究空間環境對植物生長發育的影響具有十分重要的科學意義。本研究通過流平衡分析初步探討了微重力對擬南芥生長發育的影響機制，得到與實驗觀察一致的結果，即微重力環境會影響擬南芥的生長，使其生物質合成降低，導致擬南芥生長緩慢。同時，從擬南芥各器官組織來看，微重力環境對擬南芥根的影響最大，使其生物質和ATP 的產量較地面環境組均有所下降，這也與微重力環境下擬南芥出現較短的根的實驗結果一致。流平衡分析表明，微重力環境下根較短的原因可能是線粒體電子傳遞鏈受到的影響較大導致其生物質合成降低。而導致擬南芥幼苗生物質合成下降的原因不是由于微重力對線粒體電子傳遞鏈的影響，關于其深層機制需要開展進一步分析研究。