miRNA-335通過抑制HDAC3改善帕金森病的炎癥反應研究

陳緒才，王 益，紀雪晴，倪芳芳

(句容市人民醫院 神經內科，江蘇 句容 212400)

0 引言

帕金森病(PD)是65歲以上成年人中第二常見的神經退行性疾病。帕金森病的特征癥狀，如靜止性震顫、運動遲緩、姿勢不穩和步態失衡，被認為是黑質致密部(SNpc)大部分多巴胺(DA)神經元進行性退化的結果，導致紋狀體DA信號的丟失[1]。帕金森病的病理特征是α-突觸核蛋白在路易體包涵體中的顯著積聚[2]。此外，帕金森病的特點是T細胞的滲透和小膠質細胞及星形膠質細胞的堆積，以及與膠質細胞的形態和功能的改變有關[3]。

雖然PD和其他神經退行性疾病相關的免疫反應已被研究多年，但鮮見廣泛研究，尤其是從分子角度的研究。此外，神經退行性病變的免疫反應，包括PD，通常只被認為是次要的和不重要的。然而，有證據表明，炎癥可能具有比最初認為的更大的功能。有證據表明，激活的小膠質細胞的存在對DA神經元有益，但大多數研究結果都得出了神經炎癥實際上對SNpc神經元有害的結論。研究表明，激活的小膠質細胞可以產生和釋放大量有害化合物，如活性氧、活性氮、促炎前列腺素和細胞因子[4]。

microRNA(miRNA)作為一種非編碼RNA，通過翻譯抑制、直接或間接調控以及轉錄后降解來調節基因表達，miRNA被認為是與某些疾病進展相關的潛在治療靶點，包括PD[5]。體外和體內證據都表明，miRNA通路是中腦DA能神經元分化所特有的。越來越多的證據表明，包括miR-133b，miR-7/miR-153，miR-205，miR-132和miR-494在內的多種miRNA參與了PD疾病進展的調節[6]。

6-羥多巴胺(6-OHDA)是一種能導致多巴胺神經元死亡的神經毒素，常用來建立體內和體外的帕金森病實驗模型[7-8]。在本研究中，采用6-OHDA誘導大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)建立PD體外模型，探索miRNA-335是否通過介導其靶基因組蛋白脫乙酰酶3(HDAC3)的水平影響PD的炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細胞系購自上海賓穗生物科技有限公司，6-OHDA購自上海澤葉生物科技有限公司，F-12K培養基、胎牛血清、CCK-8試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Elisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所；miRNA-335引物[9]的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HDAC3和核轉錄因子-κB(NF-κB)一抗購自Cell Signaling公司。

1.2 方法

將PC12在含有10%質量分數胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 F-12K 培養基中，于37 ℃，5%體積分數CO2培養箱中培養48 h。然后，將細胞分成4組，分別為空白組、模型組(100 μmol/L 6-OHDA)、pre-miRNA-335組(100 μmol/L 6-OHDA+30 nmol/L miRNA-335前體寡核苷酸)和anti-miRNA-335組(100 μmol/L 6-OHDA+30 nmol/L miRNA-335抑制劑)，繼續培養24 h。

1.3 細胞活力及炎癥因子的測定

按照試劑盒說明書，采用CCK-8法測定各組的細胞活力，并按照試劑盒說明書測定各組上清液中IL-1β和TNF-α的水平。

1.4 miRNA-335及HDAC3和NF-κB表達的測定

采用實時定量PCR測定各組miRNA-335的表達水平，采用Western blot測定各組HDAC3和NF-κB的蛋白表達水平[10]。

1.5 統計學處理

所有數據均以平均值(mean)±標準誤(s)表示，采用SPSS 22.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey’s post-hoc檢驗，P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 6-OHDA對miRNA-335表達的影響

與空白組相比，6-OHDA處理后，miRNA-335表達水平顯著降低；且轉染miRNA-335前體寡核苷酸組(不用6-OHDA處理)與空白組相比，miRNA-335表達水平顯著升高，而轉染miRNA-335抑制劑組(不用6-OHDA處理)與空白組相比，miRNA-335表達水平顯著降低，這表明細胞轉染實驗成功，如圖1所示。

圖1 6-OHDA對miRNA-335表達的影響注：數據結果用mean±s表示，n=5；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001。

2.2 miRNA-335對6-OHDA誘導后PC12細胞活力及炎癥因子的影響

與空白組相比，模型組細胞活力顯著下降、IL-1β和TNF-α表達顯著升高，而pre-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與模型組相比，細胞活力顯著升高，而IL-1β和TNF-α表達顯著降低，且anti-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與空白組和模型組相比，細胞活力均顯著下降、IL-1β和TNF-α表達均顯著升高，如圖2所示。

圖2 miRNA-335對6-OHDA誘導后PC12細胞活力、IL-1β和TNF-α水平的影響注：數據結果用mean±s表示，n=5；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001；與模型組比較，“*”表示P <0.05，“**”表示P < 0.01，“***”表示P < 0.001。

2.3 miRNA-335對6-OHDA誘導后PC12細胞HDAC3和NF-κB蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組HDAC3和NF-κB蛋白表達顯著上升，而pre-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與模型組相比，HDAC3和NF-κB蛋白表達顯著降低，且anti-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與空白組和模型組相比，HDAC3和NF-κB蛋白表達均顯著升高，如圖3所示。

圖3 miRNA-335對6-OHDA誘導后PC12細胞HDAC3和NF-κB蛋白表達的影響注：數據結果用mean±s表示，n=4；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001；與模型組比較，“*”表示P <0.05，“**”表示P < 0.01。

3 討論

miRNA是轉錄后基因表達調節因子，在神經元可塑性、發育和疾病中發揮關鍵作用[11]，作為小的內源性非編碼RNA分子，miRNA在包括PD在內的各種疾病的發生和發展中發揮著關鍵作用。中腦DA能神經元中，miR-133b抑制垂體同源框3轉錄因子(Pitx3)的表達，Pitx3缺乏會導致黑質紋狀體DA的選擇性損失[12]。α-突觸核蛋白在PD發病機制中起重要作用，雖然點突變體與PD相關，但α-突觸核蛋白水平升高也會導致PD發展，miR-7調節內源性α-突觸核蛋白水平，其對突觸核蛋白表達的抑制保護免受氧化應激介導的細胞死亡[13]。

有研究表明海馬組織中的HDAC3抑制通過控制小膠質細胞激活、增強樹突棘密度和降低 APP/PS1小鼠的Aβ負荷有效緩解空間記憶缺陷[14]。在較早的一項研究中對miRNA表達譜的調查顯示，miRNA-335在阿爾茲海默癥(AD)患者的皮質灰質和白質中下調[15]，且miRNA-335的上調可減少細胞凋亡，而miRNA-335的敲低可放大炎癥介質(包括IL-1β和TNF-α)的水平[16]。據報道，HDAC3通過調控NF-κB p65脫乙酰化而促進炎癥的發生發展[17]。而最近的證據表明，活化的小膠質細胞能夠對SNpc的DA神經元造成自身損害，主要通過促炎細胞因子如IL-1β的上調和釋放，最終導致NF-κB的激活[18]。

本研究發現，6-OHDA處理后，PC12細胞活力、miRNA-335水平顯著下降，而炎癥因子、HDAC3和NF-κB蛋白水平顯著升高，而當miRNA-335過表達時，可以顯著改善上述異常表達的指標，而敲低miRNA-335表達時，可以加劇上述指標的異常。

4 結語

綜上所述，miRNA-335可能通過靶基因HDAC3調控NF-κB的表達，從而調控炎癥因子的表達，進而改善PD的炎癥反應。