SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1在老年COPD患者中的表達及與肺功能指標的相關性

毛 俊，王 柯

1.湖北省武漢市優撫醫院檢驗科，湖北武漢 430000；2.湖北省武漢市金銀潭醫院呼吸內科，湖北武漢 430040

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性、進行性氣道炎癥性疾病，好發于老年人，以持續性呼吸道癥狀和進行性氣流阻塞為特征，嚴重影響患者肺通氣功能[1]。全球每年因COPD死亡的人數已經超過 300萬，盡管臨床上在預防治療COPD急性加重期方面取得了一定成就，但仍不能抑制疾病進展[2]。因此，尋找老年COPD相關生物學指標對改善患者預后十分重要。表面活性蛋白D(SP-D)是一種與肺先天免疫相關的鈣依賴性凝集素，以多種方式介導病原體的清除，在肺宿主防御中發揮重要作用，被認為是診斷肺損傷的生物標志物[3]。趨化因子配體13(CXCL13)是B細胞趨化因子，可調節B細胞聚集至炎癥病灶，在自身免疫性疾病中CXCL13合成增加，并且與疾病進展相關[4]。長鏈非編碼RNA漿細胞瘤轉化遷移基因1(lncRNA PVT1)是一種與腫瘤相關的lncRNA，參與肺癌細胞增殖分化及侵襲轉移過程[5]。本研究擬探討老年COPD患者血清中SP-D、CXCL13及lncRNA PVT1表達特點，并分析以上指標與肺功能的相關性，旨在為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年3月至2021年5月湖北省武漢市優撫醫院收治的300例老年COPD患者為研究對象。(1)納入標準：①均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》診斷標準[6]；②年齡≥65歲；③入組前未接受過抗感染治療。(2)排除標準：①合并肺組織良、惡性腫瘤及其他部位惡性腫瘤；②合并肺結核、哮喘、肺源性心臟病、感染性肺炎；③合并自身免疫性疾病。其中急性加重期患者135例(急性加重期組)，穩定期患者165例(穩定期組)，急性加重期患者均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(2017年更新版)》[7]相關診斷標準。另選擇同期在湖北省武漢市優撫醫院進行體檢的65例健康者納入對照組，均排除呼吸系統疾病、感染及免疫性疾病。所有研究對象自愿參與本研究，并簽署知情同意書。本研究獲得湖北省武漢市優撫醫院醫學倫理委員會批準。

1.2血清標本采集及檢測 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血3 mL，注入干燥試管，室溫下靜置30～60 min，凝固后取上層液離心(參數：半徑10 cm，轉速3 000 r/min，時間15 min)，取血清于—70 ℃冰箱保存待檢。采用Varioskan LUX 多功能酶標儀(美國賽默飛公司，比色夾心酶聯免疫吸附試驗)檢測血清SP-D、CXCL13水平，試劑盒購自美國R&D公司。取血清標本，加入TRIzolTMplus RNA凈化試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總 RNA，采用M-MLV反轉錄酶(美國Promega公司)將 RNA反轉錄為cDNA，采用Step One PlusTM實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)系統(美國賽默飛Applied Biosystems)進行qRT-PCR分析，采用2—ΔΔCt法計算lncRNA PVT1相對表達水平，lncRNA PVT1引物序列：正向引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，反向引物為5′-AGAGACACCAAGACTGGCTCT-3′。β-actin(內參)正向引物為5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′；反向引物為5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反應體系：DNA模板2 μL，正、反向引物各1 μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25 μL，加RNase-Free ddH2O 21 μL。反應條件： 95 ℃預變性3 min， 98 ℃變性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環30次。

1.3肺功能指標檢測 COPD患者入組當日、健康者體檢當日，采用FGC-A肺功能測試儀(安徽電子科學研究所)檢測第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1與用力肺活量(FVC)比值(FEV1/FVC)、FEV1占預計值百分數(FEV1%pred)。

2 結 果

2.13組基線資料、肺功能指標比較 3組年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。急性加重期組、穩定期組合并基礎疾病比例、吸煙史比例高于對照組，FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。急性加重期組FEV1、FEV1/FVC、 FEV1%pred低于穩定期組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.23組血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達比較 急性加重期組血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達均高于穩定期組和對照組，穩定期組血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達與肺功能指標的相關分析 COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達均與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈負相關(P<0.05)。見表3。

2.4SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩定期的效能 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩定期的曲線下面積(AUC)分別為0.707、0.671、0.696。SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1聯合檢測鑒別COPD急性加重期和穩定期的AUC為0.878，大于SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1單獨檢測的AUC(Z=5.922、6.741、6.470，P<0.05)，見表4和圖1。

表1 3組基線資料、肺功能指標比較或n(%)]

組別n基礎疾病糖尿病高血壓高脂血癥FEV1(L)FEV1/FVC(%)FEV1%pred(%)急性加重期組13562(45.93)*73(54.07)*54(40.00)*43.65±4.41*#56.80±5.79*#58.24±6.35*#穩定期組16580(48.48)*89(53.94)*62(37.58)*55.02±6.72*64.28±5.17*67.01±7.06*對照組6513(20.00)15(23.08)10(15.38)77.35±8.9579.26±7.0276.01±8.43F/χ216.53620.45413.005595.947333.056146.446P<0.001<0.0010.001<0.001<0.001<0.001

表2 3組血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達比較

表3 SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達與肺功能指標的相關分析

表4 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩定期的效能

圖1 SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1鑒別COPD急性加重期和穩定期的ROC曲線

3 討 論

COPD 是全球第三大死亡原因，吸煙、空氣污染、職業暴露是COPD發病的高危因素[8]。老年人由于機體功能衰退，免疫力和抵抗力減弱，加之共病的影響，更容易發生COPD，持續的慢性炎癥反應、漸進性氣流受限導致氣道狹窄，黏液阻塞，肺實質破壞和肺彈性喪失，影響肺通氣功能。隨著COPD癥狀加重和惡化，肺功能逐漸降低，嚴重影響患者的生活質量[9]。

SP-D是一種上皮細胞衍生的免疫調節劑，主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞和下呼吸道Clara細胞分泌，具有免疫調節、抗菌、參與肺初始免疫應答等作用，在維持肺表面活性劑穩態、肺先天免疫中發揮重要作用[10-12]。本研究發現急性加重期組血清SP-D水平高于穩定期組和對照組，表明SP-D與COPD發病及急性發作均有關，檢測血清SP-D水平可反映COPD病情變化。相關分析結果顯示，SP-D與FEV1、FEV1/FVC、FEV1%pred呈負相關，說明SP-D水平越高，肺功能損傷越嚴重，SP-D水平升高可能原因為響應肺組織局部炎癥刺激，肺組織損傷越嚴重，肺泡表面合成SP-D越多。LPEZ-CANO等[13]報道SP-D水平在肥胖2型糖尿病肺損傷患者血清中升高，且與FEV1呈負相關。YAMAKAWA 等[14]研究結果顯示，血清 SP-D 水平升高是系統性硬化癥和混合性結締組織病并發間質性肺疾病的潛在預測因子，與肺活量下降有關。分析SP-D參與COPD的機制為轉化生長因子β可誘導SP-D水平升高，且可調節肺泡上皮細胞及免疫細胞，在炎癥環境中轉化生長因子β增加 SP-D表達，從而參與宿主免疫防御[15]。

CXCL13是一種B淋巴細胞趨化因子，由濾泡樹突細胞和巨噬細胞在次級淋巴器官中產生，CXC 趨化因子受體5是CXCL13的受體，CXCL13通過激活CXC 趨化因子受體5調節B細胞和T細胞亞群歸巢，在免疫反應調節中發揮重要作用[16]。本研究發現血清CXCL13水平在COPD患者中也明顯升高，且在急性加重期更高，說明CXCL13可促使COPD發病和病情加重。本研究中相關分析結果顯示，CXCL13水平與肺功能指標呈負相關，提示CXCL13水平升高可誘導肺功能下降。ALTURAIKI等[17]研究結果顯示CXCL13水平在呼吸道合胞病毒感染小鼠模型中升高，并促使氣道淋巴細胞聚集。XUE等[18]報道血清CXCL13水平升高與間質性肺疾病的嚴重程度顯著相關，是間質性肺炎診斷的標志物。分析CXCL13參與COPD的可能機制為三級淋巴器官(也稱異位淋巴樣組織)在COPD 進展中起關鍵作用，T濾泡輔助樣細胞表面CXCL13在樹突狀細胞誘導下表達增加，并促使異位淋巴樣組織產生[19]，異位淋巴樣組織可促使肺組織病理纖維化、肺功能惡化[20]。

lncRNA PVT1是原癌基因 N-myc的下游基因，在包括肺癌在內的多種惡性腫瘤中表達上調，并與腫瘤預后密切相關[21]。已知lncRNA PVT1參與哮喘發病，lncRNA PVT1通過負向調控miR-15a-5p或海綿miR-29c-3p，激活磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶-B-哺乳動物雷帕霉素靶分子信號傳導，促使CD4+T 細胞向輔助性T細胞2分化，從而誘導氣道炎癥反應發生，促進氣道平滑肌細胞增殖和氣道重塑[22]。本研究發現lncRNA PVT1與COPD也存在密切關系，lncRNA PVT1高表達與肺功能下降有關，分析可能的原因為miR-146a是lncRNA PVT1的靶點，也是公認的慢性氣道呼吸系統疾病的抗炎介質，可抑制COPD腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、白三烯B4等致炎介質表達，發揮保護作用[23]，miR-146a是lncRNA PVT1的下游靶標，lncRNA PVT1通過負向調控miR-146a誘導炎癥反應，參與COPD發病過程[24]。

綜上所述，老年COPD患者血清SP-D、CXCL13水平及lncRNA PVT1表達均升高，高水平SP-D、CXCL13，高表達lncRNA PVT1與COPD急性加重及肺功能下降均有關。本研究不足之處為尚未分析SP-D、CXCL13、lncRNA PVT1與老年COPD患者臨床治療結局的關系，待進一步追蹤臨床治療結局加以證實。