EMRE在高糖環境中的變化對心肌細胞凋亡機制的研究

曹興丹 陳子儀 宋小剛 張玉秀 陳敏 湯吉超 李萍萍 荊哲 陳永清

(1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院基礎醫學實驗室 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730050；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院心血管內科，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省中心醫院心血管內科，甘肅 蘭州 730070)

糖尿病已成為全球問題，并已迅速進展為全球增長最快的疾病之一，預計2045年約有6.93億成年人將受到該疾病的影響[1]，全球成人糖尿病患病率已從1980年的4.7%上升至2014年的8.5%[2]。而在糖尿病患者中心血管疾病是其主要的并發癥之一，尤其是糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)，其發病率和死亡率逐年升高，與此同時它也是糖尿病患者死亡的主要原因[3-5]。研究[6-7]指出由于機體長期慢性暴露于高血糖環境中，可誘導心肌組織和細胞代謝紊亂，導致心臟結構的改變，尤其是左心室壁僵硬和左心室功能障礙，最終引起心力衰竭的發生。而在這一過程中，心肌細胞凋亡或壞死是引發DCM的關鍵致病因素，但具體的分子機制目前尚不清楚。以往研究[8]發現，與鈣穩態失衡和氧化應激所致的活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加有關的線粒體功能紊亂，可能在參與心肌細胞凋亡途徑中起主導作用。其中一個重要的分子鈣調節蛋白，即線粒體鈣單向轉運活性體必須蛋白(essential mitochondrail calcium uniporter regulator，EMRE)，可作為線粒體鈣攝取的關鍵分子[9]，并與線粒體鈣離子單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)、線粒體鈣離子攝入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1，MICU1)等共同構成鈣通道復合體[10-13]，維持線粒體鈣穩態，從而影響細胞凋亡。既往研究[14]發現，在高糖高脂誘導小鼠心肌細胞內EMRE表達升高，ROS生成增多，進而促進了心肌細胞凋亡。這只是一個對EMRE分子表達的初步探究，它與細胞的凋亡關系及對細胞凋亡的影響機制需進一步探討。本實驗通過對糖尿病小鼠和高糖誘導的H9c2心肌細胞中EMRE的表達情況，以及相關凋亡因子、線粒體ATP濃度、ROS、細胞凋亡等的水平進行檢測，進一步探究EMRE在高糖環境下心肌細胞內的表達水平及其參與心肌細胞凋亡過程的可能機制，為今后在DCM的靶點治療方面提供新思路與策略。

1 材料與方法

1.1 材料

db/db糖尿病小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠均購買自常州卡文思實驗動物有限公司。H9c2心肌細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。DMEM培養基、蛋白濃度測定試劑盒、線粒體分離試劑盒、ECL Plus超敏發光液均購自索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司，胰酶EDTA溶液購自上海源培生物有限公司，EMRE抗體、caspase-3、Bax、caspase-9、細胞色素c(cytochrome c，Cyto-c)、MCL-1抗體以及兔抗鼠β-actin多克隆抗體購自Affinity Biosciences公司，SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒購自艾科瑞生物有限公司，ATP檢測試劑盒、α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH)活性檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購自上海吉馬公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

實驗分為兩部分：(1)將購買來的db/db糖尿病小鼠及WT小鼠各6只，在相同條件下飼養18周，每組隨機選取3只，提取心肌組織蛋白及RNA，利用蛋白質印跡法及實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測EMRE的表達情況，免疫組織化學法檢測EMRE的表達水平，小動物超聲儀檢測小鼠的心臟功能。(2)將H9c2心肌細胞隨機分為四組，即正常組(NG，培養基中含5.5 mmol/L葡萄糖)，高糖組(HG，培養基中含33 mmol/L葡萄糖)，高糖+陰性對照組(HG+NC siRNA，培養基中含33 mmol/L葡萄糖+陰性對照siRNA)，高糖+轉染EMRE組(HG+EMRE siRNA，培養基中含33 mmol/L葡萄糖+轉染EMRE siRNA)，將細胞置于T25培養瓶中，培養條件為37 ℃，5% CO2，pH值維持在7.3～7.5，無菌恒溫培養24 h，觀察細胞生長狀態，當細胞生長至75%～80%后可進行下一步實驗。

1.2.2 蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平

(1)心肌組織EMRE蛋白表達水平檢測。將實驗動物處死后，剪取每組動物的心肌組織40～50 mg，預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗兩次，濾紙吸干血跡，利用研磨儀研磨組織，充分研磨組織至勻漿狀態，再次經過PBS清洗后，加入組織裂解液，冰上裂解0.5 h后，4 ℃離心，取上清液，進行蛋白濃度測定，根據蛋白濃度計算出每個樣品可取25 μg，分別加入已配置好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)中，完成電泳。然后根據所需蛋白分子量大小設置轉膜時間及電壓，轉膜至聚偏二氟乙烯膜后利用5%脫脂牛奶封閉1 h，最后對膜進行漂洗，孵育一抗，4 ℃搖床過夜，次日再次孵育二抗2 h，最后曝光顯影。

(2)H9c2心肌細胞EMRE蛋白表達水平檢測。用細胞裂解液提取各實驗組細胞中的蛋白，并做好標記，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測每組細胞提取的蛋白濃度，并采用蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平，檢測方法同1.2.1。

(3)H9c2心肌細胞線粒體蛋白表達水平檢測。將實驗細胞用4 ℃預冷的PBS清洗后，用胰酶消化液消化細胞并收集至離心管內，室溫離心5～10 min，添加含苯甲基磺酰氟的線粒體分離試劑，冰浴靜置10～15 min。利用玻璃勻漿器勻漿后，4 ℃離心10 min。取上清液，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀為得到的細胞線粒體。在分離得到的線粒體樣品中可加入150～200 μL的線粒體裂解液裂解線粒體。裂解后的線粒體蛋白樣品可用于線粒體蛋白濃度測定，采用蛋白質印跡法檢測蛋白表達，檢測方法同1.2.1。

1.2.3 RT-qPCR法檢測mRNA的表達水平

將實驗動物處死后，剪取其小鼠前壁心肌組織，利用勻漿器勻漿處理后，利用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒提取所需mRNA，將提取的RNA進行反轉錄形成cDNA后，利用SYBR-Green嵌合熒光法進行qPCR反應。用于qPCR反應的目的基因EMRE引物上游序列為：5’-TCCGATTGATCCCCTTTCTC-3，下游序列為5’-GCTTTCCTTGZCCCTTCTGC-3’，內參基因GAPDH的上游序列為5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游序列為5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。反應條件為95 ℃，30 s，1個循環；95 ℃，5 s以及60 ℃，30 s，分別40個循環，反應完成后，用GraphPad Prism 8進行數據分析。

1.2.4 免疫組織化學法檢測EMRE的表達水平

剪取處死后的實驗組小鼠的前壁心肌組織，并經過甲醛固定、酒精脫水、二甲苯透明以及浸蠟、包埋、切片、烤片處理后，再次進行組織切片脫蠟水化，高溫高壓抗原修復2 min，然后利用過氧化氫溶液浸泡15 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育20 min，二氨基聯苯胺顯色，之后進行蘇木精溶液復染，脫水、封片處理，最后鏡檢觀察。

1.2.5 小動物超聲儀檢測心臟功能

對實驗小鼠備皮，并給予小鼠吸入異氟烷進行麻醉，選用美國Visualsonics公司的超高分辨率小動物超聲影像系統進行小鼠心臟功能檢測，利用Vevo 2100軟件進行數據分析，并計算小鼠左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)大小。

1.2.6 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率

將匯合度已達到90%且生長狀態良好的實驗細胞利用胰酶消化后收集到離心管內，1 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液，PBS重懸細胞后，置于高速離心機中1 000 r/min離心5 min，緩沖液重懸細胞后取10 μL Annexin V-FITC細胞凋亡檢測熒光試劑滴加至細胞懸液中，同時再滴加入5 μL細胞核酸染料碘化丙啶，充分混合，避光條件下，室溫反應15 min，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 線粒體ATP水平檢測

將六孔板中每個樣品孔內加入200 μL的細胞裂解液，細胞裂解完成后，置于高速離心機中，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，然后各吸取20 μL ATP標準稀釋液及ATP檢測工作液200 μL加入樣品孔中。用酶標儀進行檢測，制備標準曲線，計算ATP濃度。

1.2.8 線粒體α-KGDH活性檢測

根據α-KGDH活性檢測試劑盒說明進行操作，取500萬細胞，勻漿器充分研磨，4 ℃，11 000 r/min離心10 min，取200 μL的工作液加入檢測樣品中，37 ℃孵育5 min后再加入酶活性檢測試劑8 μL和12 μL蒸餾水，混勻并立即測量340 nm處0 s的吸光值及340 nm處2 min時的吸光值，最后根據吸光值計算α-KGDH活性。

1.2.9 細胞ROS水平檢測

根據ROS檢測試劑盒說明，用無血清培養液稀釋活性氧熒光探針(DCFH-DA)試劑，將稀釋好的DCFH-DA工作液加入六孔板中，恒溫細胞培養箱內孵育20 min，最后利用Hank’s平衡鹽緩沖液清洗3次，熒光顯微鏡拍照記錄。

1.2.10 統計學處理

使用GraphPad Prism 8軟件進行數據統計學分析，用均數±標準差表示各組數據，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EMRE表達水平與糖尿病小鼠心臟功能的關系

蛋白質印跡法結果顯示，與WT組小鼠比較，db/db小鼠組小鼠心肌中EMRE蛋白表達水平升高(P<0.01)，見圖1A。RT-qPCR檢測結果顯示，與WT組小鼠比較，db/db小鼠組心肌中EMRE mRNA表達水平升高(P<0.01)，見圖1B。免疫組織化學法檢測結果顯示，與WT組小鼠相比較，EMRE表達水平在糖尿病小鼠心肌組織中升高，見圖1C。對db/db糖尿病小鼠及WT小鼠進行活體小動物超聲檢測，與WT組小鼠相比較，db/db糖尿病小鼠組小鼠LVEF降低、LVFS降低(P<0.01)，見圖2。結果提示：db/db糖尿病小鼠心肌中EMRE的表達升高，可能導致糖尿病小鼠心臟收縮功能降低。

注：圖A為EMRE蛋白表達情況(***表示P<0.001)；圖B為EMRE mRNA表達情況(***表示P<0.001)；圖C為免疫組織化學法檢測EMRE的表達情況(200x)，n=6。

注：圖A為小動物超聲左心室短軸M型圖像；圖B為兩組小鼠LVEF值；圖C為兩組小鼠LVFS值；**表示P<0.01。

2.2 下調EMRE表達對H9c2心肌細胞凋亡的影響

下調高糖環境下H9c2心肌細胞中EMRE的表達，蛋白質印跡法結果顯示，與NG組相比較，HG組中H9c2心肌細胞EMRE蛋白的表達水平升高(P<0.01)，HG+EMRE siRNA組，H9c2心肌細胞中促凋亡蛋白caspase-3表達下降(P<0.01)，見圖3；與NG組相比較，HG組H9c2心肌細胞中凋亡蛋白caspase-9、Bax表達升高(P<0.001，P<0.01)，凋亡拮抗蛋白MCL-1表達受到抑制(P<0.01)，而HG+EMRE siRNA組，促凋亡蛋白caspase-9、Bax表達下降(P<0.05，P<0.01)，MCL-1蛋白表達升高(P<0.05)，見圖4；HG組H9c2心肌細胞線粒體凋亡蛋白Cyto-c表達升高(P<0.001)，HG+EMRE siRNA組中Cyto-c表達下降(P<0.05)，見圖5。流式細胞術檢測心肌細胞凋亡結果顯示，與NG組相比較，HG組心肌細胞的凋亡水平升高，而HG+EMRE siRNA組中H9c2心肌細胞凋亡水平下降，見圖6。結果提示：高糖環境可誘導H9c2心肌細胞發生線粒體內源性途徑凋亡，下調EMRE的表達可抑制H9c2心肌細胞凋亡。

注：**表示P<0.01；***表示P<0.001。

注：*表示P<0.5；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

注：PI，線胞核染料碘化丙啶。

2.3 下調EMRE表達對H9c2心肌細胞線粒體ATP生成的影響

利用ATP檢測試劑盒進行檢測結果顯示，與NG組相比較，高糖環境下ATP濃度明顯下降(P<0.01)，而下調EMRE表達后，ATP濃度較HG升高(P<0.01)。利用α-KGDH活性檢測試劑盒對α-KGDH活性進行檢測結果顯示，與NG組相比較，高糖環境下α-KGDH活性下降，下調EMRE表達后，可增加α-KGDH活性(P<0.01)，見圖7。結果提示：下調EMRE的表達可激活α-KGDH活性，促進ATP生成。

注：圖A為線粒體ATP濃度；圖B為α-KGDH活性；**表示P<0.01。

2.4 下調EMRE促進H9c2心肌細胞ROS的生成

利用ROS檢測試劑盒進行檢測結果顯示，與NG組相比，高糖環境下ROS的水平明顯升高(P<0.01)，當下調EMRE表達后，ROS水平較前明顯降低(P<0.01)，見圖8。結果提示：下調EMRE表達可抑制H9c2心肌細胞ROS生成。

注：**表示P<0.01。

3 討論

糖尿病是以慢性高血糖為特征，導致細胞運輸和利用葡萄糖能力障礙的異質性代謝紊亂疾病[15-16]。其目前是健康人群罹患心血管疾病的重要危險因素，其中DCM是其主要的并發癥，現已成為糖尿病患者死亡的主要原因[17-19]。因此DCM也日益成為人們關注的健康問題。它是一種由慢性高糖環境誘導心肌細胞發生結構和功能的改變，最終導致患者發生心力衰竭甚至死亡的疾病[20]。高血糖已被證實可通過一些有害機制參與心臟的代謝和功能改變，從而激活細胞凋亡過程[21]。而在高血糖誘導心功能損害的病理機制中，線粒體鈣穩態是維持細胞內環境穩態的決定因素之一，也是細胞存活和凋亡通路的信號樞紐[22]。同時，研究[23]發現EMRE作為線粒體鈣攝取的關鍵分子，其表達活性的異常可能會導致線粒體鈣攝取異常，進而影響線粒體功能，誘導細胞凋亡。其功能的喪失可能將破壞細胞鈣穩態，影響細胞功能[24]。但是EMRE在高糖環境下是如何影響線粒體功能進而參與心肌細胞凋亡的發生，當改變EMRE表達活性后又將如何影響心肌細胞凋亡，這些機制目前尚不清楚。本研究擬以糖尿病狀態下EMRE的表達變化及機制，圍繞EMRE對線粒體功能及其對線粒體氧化應激的調控，探討心肌細胞凋亡發生的新機制。

為探究EMRE在高糖環境中的變化，對db/db和WT小鼠心肌組織中EMRE表達進行了初步檢測，結果發現db/db小鼠心肌組織中EMRE表達升高，同時利用小動物超聲功能檢測發現db/db小鼠的心臟收縮功能降低。通過上述實驗研究初步了解到糖尿病環境可使EMRE的表達水平升高。為了明確EMRE活性與心肌細胞凋亡之間的關系及相關凋亡機制，以高糖環境培養的H9c2心肌細胞作為模型，觀察其對EMRE及凋亡相關蛋白表達水平的影響。結果顯示：EMRE蛋白的表達水平升高，同時促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9以及Bax、Cyto-c的表達水平也明顯升高，而抗凋亡蛋白MCL-1的表達水平明顯受到抑制，細胞的凋亡水平也顯著升高，因此EMRE在高糖環境中可能參與介導細胞的凋亡途徑。在對凋亡途徑的研究[25-27]中發現MCL-1蛋白家族參與控制內源性(線粒體)途徑，并通過MCL-1相關蛋白參與到線粒體外膜滲透中來，然后引起線粒體Cyto-c的釋放，最終激活巰基蛋白酶家族成員caspase-3、caspase-9等凋亡信號分子。本實驗結果也提示高糖環境下誘導H9c2心肌細胞凋亡途徑中存在線粒體內源性途徑，隨著EMRE蛋白分子的表達升高，線粒體內源性凋亡蛋白被進一步激活，進而促進了細胞的凋亡。為進一步驗證EMRE表達變化對心肌細胞凋亡的影響作用，利用siRNA下調高糖環境下EMRE的表達，結果顯示：下調EMRE表達后，心肌細胞的內源性凋亡受到抑制。這也更深入地證實了高糖環境可誘導EMRE的表達升高，促進了細胞內源性凋亡，而下調其表達活性后，細胞的凋亡將受到抑制。

作為心肌細胞凋亡的關鍵分子EMRE，在高糖環境培養的心肌細胞中其表達明顯升高，EMRE可能通過細胞內源性凋亡途徑影響心肌細胞凋亡。本實驗在對其具體凋亡機制的研究中發現，在高糖誘導的心肌細胞中，EMRE的表達水平升高后，心肌細胞線粒體合成ATP的能力下降，參與三羧酸循環的關鍵酶α-KGDH活性減弱，ROS水平升高，細胞凋亡水平也升高。因此高糖誘導的心肌細胞的凋亡中，EMRE作為細胞凋亡的關鍵分子，其表達活性的升高，可能誘導了線粒體功能發生障礙，然而研究發現當線粒體功能下降，線粒體受損時，細胞內ROS的含量顯著增加[28]，這也進一步促進了細胞凋亡。線粒體在許多重要的細胞正常生理功能中發揮作用，不僅通過氧化磷酸化產生ATP，同時也產生與細胞損傷有關的活性物質ROS[29-30]。線粒體是ROS產生的主要部位，研究發現隨著ROS生成的增多，氧化應激反應也進一步被激活，當機體內線粒體抗氧化系統不能維持內環境的穩定狀態時，細胞內增加的氧化損傷會導致線粒體內解耦聯蛋白及酶、脂類和蛋白質等的結構改變，從而導致ATP合成能力下降，線粒體功能嚴重受損，細胞活性也將受到極大影響[31]。因此，在高糖環境下，EMRE也成為了導致線粒體功能障礙的活化分子，通過增強氧化應激反應來損傷線粒體能量合成，破壞線粒體功能，因此EMRE分子的表達升高起了主導作用，誘導了細胞凋亡的發生。

綜上所述，高糖環境促進線粒體凋亡途徑信號異常，從而誘導心肌細胞的凋亡，而EMRE的過表達在這一途徑中發揮了重要作用，這可能是DCM發生的重要機制之一。從本研究中發現EMRE的表達改變影響了線粒體功能，進而影響心肌細胞凋亡，其對線粒體功能的影響是通過多方面因素來發揮作用，目前只在能量代謝這一方面做了初步的研究，此外還存在如線粒體鈣攝取發生異常、線粒體自噬異常、氧化應激反應等，均需進一步長期深入的探究。同時在實驗中對線粒體功能的改變觀察也較少，需在后續的實驗中進行深入研究，此外還需采取更多樣化的研究方式，如對糖尿病小鼠采用敲除目的基因的方法，以探究EMRE上游轉錄調控分子對細胞凋亡的影響，為今后基因靶向治療提供更重要的指導作用。