HPLC-QAMS法同時定量分析歸芪補血口服液中8種成分含量*

王華玲 ，鄧霞 ，任強 ，周金輝

（1.德州市中醫院藥學部，德州 253000；2.濟寧醫學院藥學院，日照 276800）

歸芪補血口服液由黨參、黃芪、茯苓、丹參等12味中藥材組方而成，臨床上主要用于治療氣血不足、氣虛血瘀之少氣懶言、神疲乏力、心悸失眠、頭暈目眩等病癥?，F代研究表明歸芪補血口服液可顯著升高失血性貧血小鼠血常規紅細胞總數、血紅蛋白含量、紅細胞容積、網織紅細胞計數、血小板總數和白細胞總數，具有良好的補血效果和免疫器官保護作用[1]。方中黃芪補氣升陽、生津養血，當歸補血活血，兩者共為君藥；黨參、丹參活血祛瘀、養血生津，制何首烏、枸杞子、女貞子補肝腎、益精血，共為臣藥；茯苓寧心安神，香菇、銀耳補氣生津、養陰理氣，三七散瘀止血，共為佐藥；甘草補脾益氣、調和諸藥，為其使藥。諸藥合用，共奏益氣補血、活血祛瘀之功?，F行的歸芪補血口服液質量標準[2]和文獻報道[3-4]僅對黃芪甲苷、阿魏酸等單體成分進行了定量控制，無法準確反映中成藥復方制劑多成分-多靶點-多途徑的整體觀特點。通過建立多指標成分質量控制模式，不斷摸索和完善中藥及其制劑原藥材源頭控制和制劑生產過程控制，最終使產品質量和臨床療效達到穩定，已成為中藥制劑質量控制的發展趨勢。

本實驗根據中醫配伍組方理論，結合中藥質量標志物的現代研究，以歸芪補血口服液方中君藥黃芪活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷，臣藥黨參特征成分黨參炔苷和紫丁香苷，佐藥茯苓活性成分去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸為定量控制指標成分，采用高效液相色譜一測多評（HPLCQAMS）法對所確定的8種定量控制指標成分含量同時進行測定，建立歸芪補血口服液多指標成分質量控制方法，以期為指導藥品生產企業和監管部門提升該制劑質量控制標準、逐步完善和穩定原藥材來源與生產過程質量控制提供參考依據。

1 材料

1.1 實驗儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hedera C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB265-S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥物及試劑 歸芪補血口服液（規格：每支10mL，批號：20190905、20191206、20200305）來源于廣西康晟制藥有限責任公司。對照品紫丁香苷（批號：111574-201605，純度95.2%）和毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201907，純度96.8%）來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品黨參炔苷（批號：PRF9121002，純度 99.9%）、芒柄花苷（批號：PRF8081121，純度99.6%）和9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PRF8101143，純度99.1%）來源于成都普瑞法科技開發有限公司；對照品去氫土莫酸（批號：PS010100，純度98.5%）、去氫茯苓酸（批號：PS010107，純度91.2%）和茯苓酸（批號：PS010073，純度99.7%）來源于成都普思生物科技股份有限公司；制備陰性供試品所用黃芪、當歸、制何首烏、枸杞子、女貞子、黨參、丹參、茯苓、香菇、銀耳、三七和甘草均來源于濟寧邦爾中藥飲片有限公司，經檢驗符合各自質量標準項下規定；乙腈（色譜純）來源于美國Fisher公司，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸對照品各適量，用70%甲醇制成混合對照品貯備液（折純后黨參炔苷0.382 mg/mL、紫丁香苷0.128 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.314 mg/mL、芒柄花苷0.196 mg/mL、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.280 mg/mL、去氫土莫酸0.152 mg/mL、去氫茯苓酸0.116 mg/mL、茯苓酸0.232 mg/mL）；精密吸取上述貯備液2.0 mL，用70%甲醇定容至50 mL，制成各成分質量濃度分別15.28、5.12、12.56、7.84、11.20、6.08、4.64 和 9.28 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密吸取歸芪補血口服液2.0 mL，用70%甲醇稀釋至25 mL，搖勻后過濾，制得歸芪補血口服液供試品溶液。按歸芪補血口服液標準項下處方比例和制備過程分別制備缺少黨參、缺少黃芪和缺少茯苓的陰性樣品，按上述方法制備陰性供試品溶液。

2.3 色譜條件及專屬性實驗 色譜柱為Agilent ZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫為25℃。流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～11 min，15.0%乙腈；11～18 min，15.0%→22.0%乙腈；18～29 min，22.0%→50.0%乙腈；29～47 min，50.0%→92.0%乙腈；47～60 min，92.0%→11.0%乙腈），流速為1.0 mL/min。檢測波長分別為254 nm（0～29 min檢測黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷）[5-12]和210 nm（29～60 min檢測去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸）[13-15]。進樣量為 10 μL。精密吸取“2.1”“2.2”項下溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣檢測，結果黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸峰形對稱，拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》規定；理論塔板數按各成分色譜峰計均≥3 500，且與相鄰色譜峰能有效分離，分離度均>1.5；陰性供試品對歸芪補血口服液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的同時測定無干擾。見圖1。

圖1 歸芪補血口服液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的高效液相色譜圖

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品貯備液各適量，用70%甲醇制成6個系列梯度濃度混合對照品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得到黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的回歸方程及線性范圍。見表1。

表1 黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的回歸方程及線性范圍

2.5 進樣精密度、重復性及穩定性實驗 精密吸取批號為20190905的歸芪補血口服液同一份供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，重復進樣6次，測得8種成分峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.10%、1.26%、0.91%、1.06%、0.87%、1.22%、1.31%和1.05%。

取批號為20190905的歸芪補血口服液供試品，按“2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積并計算各成分含量，結果8種成分含量的RSD分別為1.57%、0.85%、1.46%、0.62%、1.79%、1.83%、0.94%和1.72%。

取批號為20190905的歸芪補血口服液同一份供試品溶液，于 0、2、4、6、12、18、24 h 各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積。結果顯示歸芪補血口服液供試品溶液24 h內穩定，8種成分峰面積的RSD分別為1.06%、1.31%、1.05%、1.10%、0.79%、1.25%、1.36%和0.95%。

2.6 加樣回收率實驗 取已知8種成分含量的批號為20190905的歸芪補血口服液供試品9份，每份精密吸取1.0 mL，精密加入混合對照品溶液（黨參炔苷0.184 mg/mL、紫丁香苷0.061 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.145 mg/mL、芒柄花苷0.087 mg/mL、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.119 mg/mL、去氫土莫酸0.072 mg/mL、去氫茯苓酸0.048 mg/mL、茯苓酸 0.093 mg/mL）0.8、1.0 和 1.2 mL各3份，對照品加入量約為原有量的80%、100%和120%，再按“2.2”項方法制備加樣供試品溶液。精密吸取上述9種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，計算得8種成分平均加樣回收率及RSD分別為 98.2%（0.97%）、97.0%（1.05%）、100.1%（0.76%）、98.7%（1.32%）、99.1%（1.43%）、97.2%（0.89%）、97.3%（1.38%）和98.4%（1.69%）。

2.7 相對校正因子的測定 精密吸取“2.4”項下6個系列梯度濃度混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內參物，按公式fk/s=fk/fs=（Xk×Ys）/（Xs×Yk）（式中X代表質量濃度，Y代表峰面積，s代表內參物，k代表其他成分）計算得黨參炔苷、紫丁香苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的相對校正因子。見表2。

表2 以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內參物的黨參炔苷、紫丁香苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的相對校正因子

2.8 不同儀器、色譜柱相對校正因子耐用性考察 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中依法進樣，測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，對比考察Shimadzu LC-20A型、UltiMate 3000型高效液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18、Hedera C18、Diamonsil C18色譜柱對相對校正因子的影響。見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.9 不同柱溫對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，對比考察不同柱溫（20、23、25、27、30℃）對相對校正因子的影響。見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.10 不同流速對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，對比考察不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min）對相對校正因子的影響。見表5。

表5 不同流速對相對校正因子的影響

2.11 色譜峰定位 中成藥復方制劑多指標成分色譜峰的準確定位，是確保所建立的HPLC-QAMS法具備準確性和可行性的基礎。精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣檢測，記錄黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的保留時間，以內參物毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰為基準峰，采用相對保留時間值法在Shimadzu LC-20A型、UltiMate 3000型高效液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18、Hedera C18、Diamonsil C18色譜柱條件下對色譜峰進行定位考察。見表6。

表6 不同儀器、色譜柱各成分色譜峰的相對保留時間值

2.12 樣品含量測定 取3個批次的歸芪補血口服液供試品適量，按“2.2”項方法平行制備3份歸芪補血口服液供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，依法進樣測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的峰面積，采用外標法（ESM）和HPLCQAMS法分別計算各成分含量。見表7。

表7 黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量測定結果

3 討論

3.1 流動相選擇 中成藥復方制劑所含成分復雜，各成分極性均存在一定差異，流動性等度洗脫模式難以確保待測成分的有效分離，故本實驗選用梯度洗脫模式對歸芪補血口服液中多成分含量進行同時測定?？紤]到甲醇在低波長處存在紫外吸收，影響色譜圖基線平穩和檢測結果的準確性，因此在實驗過程中筆者參考相關文獻[5-15]，對比考察了乙腈-水[6-8]、乙腈-甲酸溶液[5，9-10，12]和乙腈-磷酸水溶液[13-14]等流動相系統，結果發現應用乙腈-水流動相體系檢測時，成分芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和去氫茯苓酸不能達到有效分離；應用乙腈-甲酸溶液流動相體系檢測時，色譜圖基線不平穩，直接影響去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量測定結果；乙腈-磷酸水溶液流動相體系檢測效果較好。在此基礎上對磷酸水溶液濃度和梯度洗脫有機相與水相的比例不斷優化，最終確定乙腈-0.05%磷酸水溶液[14-15]為流動相進行梯度洗脫，同時檢測歸芪補血口服液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的含量。

3.2 檢測結果分析 從表7歸芪補血口服液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量測定結果可以看出，HPLC-QAMS法計算結果與ESM實測值結果之間無明顯差異（RAD<2.0%），表明本研究建立的HPLC-QAMS法可用于歸芪補血口服液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時測定。同時表7的含量測定結果也反映出8種目標化學成分含量均存在一定的批間差異，尤其毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和茯苓酸較為明顯，表明本研究所建立的多指標成分質量控制方法對穩定歸芪補血口服液的產品質量具有重要意義。

歸芪補血口服液現行質量控制標準采用蒸發光散射檢測器對黃芪所含黃芪甲苷進行了定量控制，僅檢索到對該制劑所含黃芪甲苷、阿魏酸等單體成分進行定量分析的文獻報道。考慮到黃芪甲苷的化學結構中無強紫外吸收基團，僅在201 nm左右存在較弱的紫外末端吸收，同時君藥黃芪所含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類具有補氣固表調節機體免疫功能的作用[16]，黨參炔苷和紫丁香苷為臣藥黨參的主要活性成分，去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸為佐藥茯苓的特征成分，故選取上述成分作為定量控制指標成分。本研究采用HPLCQAMS法對歸芪補血口服液中8種成分黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量同時進行測定，首次建立了歸芪補血口服液多指標成分質量控制模式，所建立的方法操作簡便快速，結果準確，為歸芪補血口服液現有質量標準提供了補充和完善，對全面提升歸芪補血口服液整體控制方法、確保產品質量和臨床療效一致性、指導臨床合理用藥提供了參考數據。