血小板衍生細胞外囊泡在疾病中的功能和機制研究進展

姚春東，周 鋮，程燕妮，陳重銀，劉 佳，王 琳（通信作者）

（1 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院檢驗科 湖北 武漢 430022）

（2 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院組織工程與再生醫學研究中心 湖北 武漢 430022）

血小板是巨核細胞胞質脫落后形成的無核細胞碎片。作為血液的重要組分，血小板能黏附、聚集和形成血栓，參與凝血、止血等過程。同時，血小板能以旁分泌的方式釋放顆粒和因子，參與機體炎癥反應和腫瘤發展。細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是細胞分泌的膜狀亞細胞結構，通過轉運蛋白質、核酸和脂質分子，參與細胞間信息傳遞。近年來，越來越多研究表明細胞外囊泡是血小板與外界信息交流、發揮功能的新途徑。在多種疾病中，受刺激活化的血小板分泌血小板衍生細胞外囊泡（platelet derived extracellular vesicles, PEVs），參與病理過程調控，了解PEVs 在疾病中的作用具有重要的臨床意義，能為后續開發疾病診斷標志物與探尋治療靶點提供參考。基于此，本文對血小板衍生細胞外囊泡在疾病中的功能和機制進行綜述。

1.PEVs 概述

PEVs 是血小板激活后從質膜脫落的脂質雙層囊泡。1967 年，學者PETER WOLF 首次報道了無血小板新鮮血漿中的“微細顆粒”，這種顆粒富含磷脂且有促凝活性。激活的血小板可釋放兩種不同類型的細胞外囊泡：微泡（platelet derived microparticles, PMPs）和外泌體（platelet derived exosomes, P-exos）。PMPs 是細胞膜出芽脫離形成的粒徑100 ～1 000 nm 的囊泡，表面暴露膜聯蛋白Ⅴ結合的磷脂酰絲氨酸，表達αIIbβ3 整合素、P 選擇素、GPIbα 等蛋白。P-exos 是來源于多囊泡胞內體的粒徑為40 ～100 nm 的囊泡，MVBs 與細胞膜融合后，內含的微囊泡釋放至細胞外，形成P-exos。血液循環中的EVs主要源于血小板，PEVs 在健康人血漿中占總體EVs 含量的70%～90%。

PEVs 由2 類物質組成：（1）一類是位于表面的受體分子和黏附分子等，參與PEVs 與受體細胞的結合與信號傳遞。PEVs 表達血小板表面特異性標志物CD41（GPIIb）、CD42b（GPIbα）分子，可通過流式細胞術鑒定。PEVs 表面有GPIbα、P 選擇素、磷脂酰絲氨酸、αIIbβ3 等分子，可介導PEVs 與血管內皮細胞或單核細胞的黏附結合。（2）另一類是囊泡內含物，參與PEVs與受體細胞的物質交換，調節細胞功能。PEVs 含有豐富的miRNA、酶、脂質和生長因子等。如miR-Let-7a 通過直接靶向抗血管生成血小板反應蛋白-1（anti-angiogenic thrombospondin-1, THBS-1）促進血管形成。這些miRNA 經PEVs 遞送至細胞后，參與基因轉錄后表達活動，調控細胞表型和功能。PEVs 中還有精氨酸酶、神經酰胺、鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1 phosphate, S1P）等，在機體生理和病理變化中發揮重要作用。

2.PEVs 促進凝血和止血

CHAURASIA 等研究發現，乏氧條件會刺激血小板內缺氧誘導因子-2α（hypoxia-inducible factor-2α, HIF-2α）的表達，促進PEVs 形成和釋放，并導致缺氧相關的血栓前表型形成。在乏氧小鼠模型中，缺氧可通過促進HIF-2α 表達，加速腸系膜小動脈中血栓形成。因此，在慢性阻塞性肺病等缺氧性疾病的治療中，靶向血小板HIF-2α 和PEVs 可能是抑制血栓形成的治療策略。DYER等研究結果表明，預注射4×10個PEVs 能促進凝血酶生成和血小板聚集，PEVs 組出血時間[（86.4±29）s]顯著短于Control 組[147.5±50.5]s，差異有統計學意義（＜0.05），提示PEVs 能夠使尾靜脈出血小鼠模型的出血時間顯著減少。LOPEZ的研究結果表明，肝外傷大鼠經7.8×10個PEVs 輸注治療后，腹部失血量減少24%，差異有統計學意義（＜0.05）。因此，PEVs 具有強大的凝血活性，未來可應用于臨床創傷止血。

3.PEVs 活化與生成血小板

炎癥過程中，血液中PEVs 可滲透進入骨髓，促進造血干細胞/祖細胞向巨核細胞分化，產生血小板。QU最新研究報道，在急性肺損傷鼠模型中，血栓形成導致血小板大量消耗；此時，PMPs 可進入骨髓，通過miR-1915-3p 抑制造血干細胞/祖細胞內Rho 三磷酸鳥苷酶家族成員B（Rho GTPase family member B, Rho GTPase B）表達，刺激干細胞向巨核細胞分化，促進血小板生成，以維持血小板在血液中的正常濃度。PEVs 能通過內含的NADPH 氧化酶-1 催化超氧化物生成，誘導血小板活化。DIEHL 等發現，PMPs 中富含溶血磷脂酰膽堿，可與血小板表面溶血磷脂酰膽堿受體G2AR 結合，誘導血小板活化、遷移、聚集并形成炎癥性血小板-單核細胞聚集物。因此，炎癥過程中血小板釋放的PMPs，能夠正反饋活化血小板，釋放更多PMPs。

4.PEVs 調節血管

PEVs 在調節血管上具有“雙面性”。PEVs 既能參與疾病的發生發展，如高血壓、糖尿病等，導致血管病變；又能在疾病發生后，與血管內皮相互作用，促進血管生成。PEVs 調控血管功能的方向可能與疾病類型有關。

4.1 損傷血管內皮

PMPs 參與早期糖尿病的腎小球內皮損傷。PMPs 在糖尿病中表達升高，通過表面CXCL7 與腎小球內皮細胞結合，激活mTORC1 信號通路，使胞內活性氧水平增加，一氧化氮和超氧化物歧化酶表達下調，加重內皮損傷，導致糖尿病腎病。MCVEY研究表明，PEVs 會引起輸血相關性急性肺損傷。與新鮮血小板相比，儲存5 d 血小板分泌的PEVs 更多，PEVs 內含有的長鏈神經酰胺（C16:0、C18: 0、C20: 0）更多、S1P 更少，導致內皮功能紊亂，引起急性肺損傷。高血壓疾病中，PMPs 參與介導血管內皮異常增殖。在高血壓大鼠模型中，異常活化的血小板分泌大量PMPs，攜帶miR-142-3p 靶向腎小球內皮細胞Bcl-2 相關轉錄因子1，促進內皮細胞異常增殖，增厚血管壁。腎移植患者和腎移植大鼠模型的PMPs 內含miR-191 表達顯著升高，miR-191 靶向腎小管上皮細胞內胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase, CBS），誘導細胞凋亡，導致腎移植后缺血-再灌注損傷。

4.2 血管生成和血管保護

血管受損后血液中血小板迅速激活，分泌PEVs。PEVs 一方面促進止血、凝血，另一方面被血管內皮細胞攝取，通過調節下游基因表達，促進細胞增殖和遷移，生成新血管。2021 年TANG報道，經PEVs 預處理的脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cell,ADSC）比未處理的原代ADSC 具有更強的促血管生成作用。經PEVs 預處理的ADSC 細胞內，多種生長因子表達上調，促進HUVEC 增殖、遷移和生成新血管。此外，在血管損傷大鼠模型中，活化血小板分泌的PMPs 通過內含的TGF-β1 促進內皮祖細胞胞內Smad3 磷酸化，調節下游基因細胞黏合素C（tenascin C, TNC）、細胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A）和CDKN2A，促進內皮祖細胞增殖，修復血管損傷。PEVs 也能保護血管，減輕各種疾病導致的血管炎癥。研究表明，PEVs 將miR-25-3p 遞送至冠狀血管內皮細胞，下調整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10, Adam10）的表達，進而下調α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白Ia1、膠原蛋白IIIa1、甘油三酯、總膽固醇、IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達，能減輕動脈粥樣硬化鼠模型的血管炎癥。此外，SZILAGYI等研究表明，PMPs 能通過miR-223 保護膿毒癥引起的血管炎癥。miR-223 能下調人冠狀動脈內皮細胞ICAM-1 表達，減少血管內皮與外周血單個核細胞的黏附，發揮血管保護作用。

4.3 調節血管平滑肌細胞

在頸動脈內膜損傷大鼠模型中，PEVs 中的miR-92a-3p 通過靶向血管平滑肌細胞中的PTEN 基因，進而激活PIP3/Akt 信號通路，促進VIII 型膠原α1 鏈（collagen type VIII alpha 1 chain, Col8a1）產生和分泌，從而增加血管硬度。另一項研究表明，血管內膜損傷鼠模型中，PMPs 通過香草素受體4 型瞬時感受器電位通道（transient receptor potential vanilloid receptor, TRPV4）誘導VSMC 胞質內動態鈣震蕩，促進VSMC 從中膜向內膜的異常遷移，參與損傷后血管重塑過程。

5.PEVs 調節炎癥反應

PEVs 能與中性粒細胞、單核-巨噬細胞等相互作用，參與敗血癥、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎等多種疾病的發展。

5.1 中性粒細胞

活化的血小板通過分泌PEVs，參與系統性硬化癥的病理進展。PEVs 內的高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1, HMGB1）在SSc 患者中表達升高，通過促進中性粒細胞自噬，產生中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）誘導血管內皮細胞損傷。JIAO 等研究發現，在盲腸結扎和穿刺導致的敗血癥小鼠模型中，耗竭血小板能降低血漿P-exos 濃度、NETs 形成和減輕肺損傷。P-exos 中HMGB1、miR-15b-5p和miR-378a-3p 通過Akt/mTOR 自噬途徑誘導NETs 形成，促進敗血癥發生發展。此外，KURAVI 等發現，在血管內皮沉積的PEVs（整合素介導沉積），可通過P 選擇素或CXC 趨化因子捕獲循環中的中性粒細胞，促進中性粒細胞穿過血管進入組織。

5.2 單核-巨噬細胞

YANG 等研究發現，PMPs 中miR-4306 可下調VEGFA/ERK/NF-κB 信號通路，抑制人單核細胞衍生巨噬細胞遷移，減輕心肌梗死小鼠模型中巨噬細胞炎性浸潤。此外，FENG 等研究表明，PMPs 參與動脈粥樣硬化的病理形成。經PMPs 預處理的巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯著增加，攝取氧化低密度脂蛋白增多，最終形成泡沫細胞，加重動脈粥樣硬化。

5.3 成纖維樣滑膜細胞

多項研究表明，PEVs 促進類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）的進展。RA 患者的PEVs 能夠通過CXCL7與RA 成纖維樣滑膜細胞（rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte, RA-FLS）表面受體CXCR2 結合，激活NF-κB 通路，促進RA-FLS 侵襲和遷移，進而導致滑膜炎癥和關節侵蝕。同時，PEVs 也可誘導RA-FLS 分泌IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 等多種促炎因子，加劇炎癥反應。Chen X 等研究發現，Rac 家族小GTP 酶1（Rac family small GTPase 1, Rac1）特異性抑制劑NSC23766 能顯著抑制RA-FLS 誘導的PMPs 生成（＜0.01），并有效緩解類風濕關節炎小鼠模型的關節損傷。

6.PEVs 促進組織再生

PMPs 能促進間充質干細胞（mesenchymal stem cell,MSC）向成骨細胞分化，誘導骨再生。CAO 等發現，PMPs 與滑膜間充質干細胞（synovial MSC, SMSC）共培養后，能顯著增強SMSC 對軟骨和軟骨下表面的黏附；對軟骨缺損大鼠模型的研究表明，PMPs 能促進SMSC 歸巢至骨關節，使SMSC 遷移、黏附至受損軟骨表面，促進SMSC 增殖分化為軟骨細胞，促進軟骨再生。PMPs 也可促進肝細胞再生。XU 等研究發現，PMPs 內miR-25-3p 能靶向人胚胎肝細胞內B-細胞易位基因2（B-cell translocation gene 2, BTG2），促進細胞進入S 期，加速肝細胞增殖。

7.總結與展望

PEVs 能在創傷時促進止血和血管生成，在膿毒癥、動脈粥樣硬化等疾病中減輕血管炎癥；但同時，許多研究表明，PEVs 會導致和加重類風濕關節炎、動脈粥樣硬化、系統性硬化癥等疾病。目前關于PEVs 的研究仍存在一些問題：（1）PEVs 調節血管的“兩面性”仍需深入研究，以闡明PEVs 與血管作用的確切機制；（2）傳統方法提取的PEVs，純度和產率較低，限制其臨床轉化；（3）PEVs 在炎癥反應、組織再生中扮演的角色，仍需更深入的研究、探索和證實。對PEVs 功能和機制的深入研究，可為未來疾病診斷標志物和探尋新的疾病治療靶標提供幫助。PEVs 在止血、血管保護、炎癥治療、組織再生和臨床診斷多個領域擁有巨大潛力，是未來細胞外囊泡療法新方向之一。