基于網絡藥理學與分子對接技術探討健骨注射液治療骨質增生及類風濕性關節(jié)炎的作用機制

鄭蘇楠，彭維，蘇薇薇，程春雷，王永剛*

(1.中山大學生命科學學院，廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

健骨注射液是由馬鞭草科植物黃毛豆腐柴(PremnafulvaCraib)的干燥莖加工制成，具有活血散瘀、強筋健骨、祛風止痛等功效。健骨注射液對于類風濕性關節(jié)炎和骨質增生均有一定療效[1-2]。目前健骨注射液的研究主要集中于臨床療效及成分分析方面，尚未有針對其藥理及作用機制的研究。本研究擬采用網絡藥理學方法及分子對接技術預測健骨注射液治療骨質疏松及類風濕性關節(jié)炎的作用通路。

1 方法

1.1 健骨注射液化學成分檢測 本課題組前期研究中，應用了超快速高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)對健骨注射液的化學成分進行分析[3-5]。

1.2 化學成分對應靶點收集 通過TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫檢索活性成分作用靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將其蛋白名稱轉化為相應的基因名稱。同時通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行健骨注射液活性成分作用靶點篩選，以Probability>0為篩選標準，預測作用靶點。將上述2個數(shù)據(jù)庫平臺篩選得到的作用靶點進行合并、去重，即為健骨注射液活性成分的作用靶點。

1.3 疾病相關靶點收集 分別以“rheumatoid arthritis”和“hypertrophic osteoarthropathy”為關鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索類風濕性關節(jié)炎(RA)和骨質增生相關靶點，Score值越高就表明此靶點與疾病的聯(lián)系越密切，選取Score≥5的靶點作為作用潛在靶點，整理合并得到類風濕性關節(jié)炎和骨質增生對應的疾病靶點。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建 將篩選得到的健骨注射液活性成分靶點與疾病相關靶點取交集，并利用在線網站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制Venn圖。所得靶點交集即為健骨注射液活性成分主要作用靶點。將上述靶點導入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構建“健骨注射液-成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.5 PPI網絡構建 將上述所得健骨注射液活性成分主要作用靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇Multiple proteins之后將物種設置為Homo sapiens，選取中置信度medium confidence(0.400)，其余設置默認，得到蛋白質相互作用(PPI)網絡。

1.6 信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對作用靶點進行GO(Gene Ontology)富集分析，并通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析探尋健骨注射液治療骨質增生及類風濕性關節(jié)炎生物功能以及主要信號通路分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

1.7 分子對接 使用“Network Analyzer”插件計算網絡的拓撲屬性，選取健骨注射液核心成分和PPI網絡中Score排名前五的核心靶點進行分子對接。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載核心成分的2D結構，利用ChemBioOffice Ultra 13.0.2-Chem3D軟件將其轉化為3D結構并進行優(yōu)化，使能量最小化。在RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.pdbus.org/)下載核心靶點對應的蛋白結構，利用PyMOL 2.5.2軟件進行去水去殘基等處理。在AutoDockTools-1.5.7軟件中設置對接網格點及尺寸，使對接盒子(grid box)包裹整個蛋白。使用Vina軟件進行半柔性分子對接，結合能絕對值越高，代表受體和配體親和力越高。

2 結果

2.1 活性成分檢測結果 用 UFLC-Triple TOF-MS/MS 技術，對健骨注射液進行在線分離、鑒定了31種成分，去除同分異構體篩選后得到15種化學成分用于進行網絡藥理學研究(見表1)。

表1 健骨注射液活性成分

2.2 活性成分及疾病相關靶點收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫搜索共得健骨注射液活性成分相關靶點261個。將成分和靶點導入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構建“健骨注射液-成分-靶點”網絡(見圖1)。其中黃色節(jié)點代表健骨注射液活性成分，藍色節(jié)點代表成分對應相關靶點。對該網絡進行分析可知，該網絡圖中共有276個節(jié)點和524條邊。

圖1 “健骨注射液-成分-靶點”網絡圖

通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索得到骨質增生及類風濕性關節(jié)炎相關靶點共520個，與健骨注射液成分對應靶點取交集，如圖2所示，得到健骨注射液治療骨質增生及類風濕性關節(jié)炎主要作用靶點53個(見表2)。

圖2 健骨注射液與疾病的共同基因靶點數(shù)

2.3 網絡構建與分析

2.3.1 “健骨注射液-成分-主要靶點-疾病”網絡 將上述健骨注射液主要靶點及疾病導入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構建“健骨注射液-成分-靶點-疾病”網絡圖，如圖3所示。其中黃色節(jié)點代表健骨注射液活性成分，藍色節(jié)點代表成分對應相關靶點。對該網絡進行分析可知，該網絡圖中共有64個節(jié)點和165條邊。其中同一活性成分可能對應不同靶點，不同活性成分也可能對應同一靶點，這表明健骨注射液是通過多成分多靶點作用于疾病。其中度值(degree)排名前四的節(jié)點所對應的化學成分分別為芹菜素、木犀草素、柚皮素、香草酸，這4種成分作用靶點數(shù)量較多，表明它們可能是健骨注射液中主要藥理活性成分。因此選取這4種成分作為健骨注射液核心成分，后續(xù)進行分子對接操作。

圖3 “健骨注射液-成分-主要靶點-疾病”網絡圖

2.3.2 PPI網絡 將53個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行分析，得到PPI蛋白互作圖(如圖4)。該網絡中包含53個節(jié)點，592條邊，平均連接度為22.3，平均局部聚類系數(shù)為0.776。其中度值排名前五的節(jié)點為TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53，表明這些節(jié)點在PPI網絡中處于核心位置，節(jié)點聯(lián)系較為緊密。上述5個基因靶點可能為健骨注射液治療骨質疏松和類風濕性關節(jié)炎的核心靶點，健骨注射液發(fā)揮藥效的機制可能與這5個基因的表達相關。因此選取這5個靶點作為核心靶點進行后續(xù)分子對接操作。

圖4 健骨注射液主要作用靶點的蛋白PPI網絡圖

2.3.3 GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行富集分析，共得到328條GO富集條目，其中屬于生物學過程(biological process，BP)的264條，屬于細胞組成成分(cellular component，CC)的23條，屬于分子功能(molecular function，MF)41條。靶點基因主要參與凋亡過程的負調控、對藥物的反應、膠原分解代謝過程、炎癥反應、一氧化氮生物合成過程正調控等生物學進程，對應細胞外間隙、胞外區(qū)、質膜外側、蛋白質細胞外基質等細胞組分以及同種蛋白結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、蛋白酶結合等分子功能。GO分析結果按P值從小到大排序，排名前十的條目見表3，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，R語言可視化結果如圖5所示。

表3 GO分析結果

圖5 GO分析結果

此外，上述靶點共富集得到88條KEGG通路，相關通路有癌癥通路、美洲錐蟲病、TNF信號通路、T細胞受體信號通路等。富集通路按P值從小到大排序，排名前二十的條目如表4所示。將上述結果導入R語言進行可視化，結果如圖6所示。

表4 KEGG通路富集結果

圖6 KEGG分析結果

2.4 分子對接 利用Vina軟件將芹菜素、木犀草素、柚皮素和香草酸分別與TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53這5個核心基因靶點對應的蛋白質建立分子對接模型，預測20種對接模式，保留結合能絕對值最大的模式(見表5)。將對接結果導入PyMOL 2.5.2進行可視化(見表6)，圖中黃色虛線表示小分子配體與蛋白受體之間通過氫鍵相互作用。當結合能小于-4.25 kcal·mol-1時，化合物與靶點有一定結合活性；結合能小于-5 kcal·mol-1時，化合物與靶點有較好的結合活性；結合能小于-7 kcal·mol-1時，化合物與靶點具有強烈的結合活性[6-7]。

表5 分子對接最低結合能(kcal·mol-1)

表6 分子對接結果

3 討論

在健骨注射液治療骨質增生和類風濕性關節(jié)炎的蛋白互作網絡中，核心靶點有TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53等。其中白細胞介素6(IL-6)是一種多功能炎性細胞因子[8]，由炎性細胞因子介入導致的炎性反應在類風濕性關節(jié)炎過程中具有重要作用[9]。有研究表明，IL-6在類風濕性關節(jié)炎患者的關節(jié)滑液中大量存在，通過多種效應途徑參與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病機制，可誘導破骨細胞分化，加快類風濕性關節(jié)炎患者軟骨破壞[10-11]。有研究表明TNF-α刺激滑膜細胞與成纖維細胞，大量分泌產生IL-6影響疾病經進程。此外，類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與TNF信號通路中IL-6、TNF和PTGS2的異常表達有關[12]。

通過KEGG信號通路氣泡圖顏色和大小可以得出，健骨注射液作用的主要通路包括癌癥通路、美洲錐蟲病、TNF信號通路、T細胞受體信號通路等。炎癥因子與癌癥密切相關，可以作用于腫瘤的發(fā)生、惡性轉化及轉移等疾病進程。NF-κB信號轉導作為炎癥的一個整體啟動子，在炎癥和腫瘤之間起到重要作用[13]。研究表明，在骨性關節(jié)炎患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤信號通路的高調控，腫瘤通路可能為骨性關節(jié)炎治療和診斷的潛在靶點基因[14]。T細胞受體在T細胞的功能和免疫突觸的形成中起著關鍵作用。T淋巴細胞的活化是免疫系統(tǒng)有效反應的關鍵，T細胞受體的活化受多種共刺激受體的調節(jié)[15]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)骨質增生及類風濕性關節(jié)炎與美洲錐蟲病存在直接聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法，構建出“健骨注射液-靶點-疾病”網絡模型，對健骨注射液治療骨質增生和類風濕性關節(jié)炎的機制進行了初步預測，分析了健骨注射液治療疾病相關靶點及信號通路，發(fā)現(xiàn)健骨注射液通過多成分多靶點對疾病反應進行調控。但本研究尚未對預測的作用機制進行驗證，將在后續(xù)研究中繼續(xù)驗證。