養肺控瘤方通過Beclin-1促進自噬并抑制肺癌細胞A549轉移*

沈水杰，陳 璇，顧小俠，姜水菊，姚登福

（1.南通市中醫院，江蘇 南通 226000；2.蘇州科技城醫院，江蘇 蘇州 215153；3.南通市第三人民醫院，江蘇 南通 226000；4.南通大學附屬醫院，江蘇 南通 226001）

與I型細胞程序性死亡凋亡不同，自噬被認為是屬于II型細胞程序性死亡的細胞死亡機制[1]。在生理條件下，自噬通過清除受損的細胞器、蛋白質聚集體和細胞內病原體等途徑，對應激條件下細胞內穩態的維持起關鍵作用。在癌癥的病理狀態下，誘導自噬激活細胞死亡（稱為自噬樣細胞死亡）可以有效促進腫瘤細胞的清除[2-4]。有相關研究表明，在癌癥治療藥物的開發中，藥物對細胞自噬作用的影響是一個很有價值的研究方向[5]。

中醫藥的使用已經延續了幾個世紀，在預防和消除腫瘤細胞方面，中藥已被證實能夠發揮重要作用[6]。臨床治療、動物及細胞試驗的研究表明：中藥具有抑制腫瘤發生、轉移和血管生成的作用[7-8]。養肺控瘤方（yangfeikongliu formula，YKF），以生黃芪、生曬參補益肺脾，益氣固本，北沙參養陰潤肺，薏苡仁、仙鶴草健脾補虛，白花蛇舌草清熱解毒散瘤，全方起益氣養陰，消瘤散結之效[9]。已有研究表明：YKF聯合順鉑可抑制荷瘤小鼠癌細胞中Lewis肺腫瘤細胞的生長和轉移[10]。此外，YKF能抑制腫瘤生長，與順鉑協同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表達[11]。但目前對于YKF影響肺癌細胞自噬作用的相關研究仍較少。

據報道，自噬相關蛋白，如Beclin-1、LC3和p62等，在癌組織中的表達減少與癌癥預后不良有關，并可能影響惡性腫瘤的發展或進展[12-14]。Beclin-1是一種重要的自噬相關蛋白，是自噬體形成所需的III類磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-III）復合物的核心成分。Beclin-1通過抑制MCF7細胞中荷瘤小鼠體外細胞生長和體內腫瘤發生的發揮其作用[15]。LC3也是通過磷脂酰乙醇胺（PE）結合形成自噬體所必需的成分之一。因此，通常通過跟蹤熒光標記LC3或在SDSPAGE凝膠上檢測快速遷移的脂化LC3（LC3-II）和LC3-I的強度比來觀察自噬活性[16]。p62（SQSTM1）是一種通過與LC3進行相互作用而發揮功能的自噬關鍵分子，p62的上調/下調與腫瘤形成、促進和抗癌治療有關[17]。目前，YKF誘導的A549細胞自噬相關蛋白的變化尚未清楚。

本研究通過檢測p62和Beclin-1的表達、LC3 II/I比值、電子顯微鏡下的自噬體和LC3斑點來評估YKF在A549細胞自噬中的作用。

1 材料和方法

1.1 YKF和含YKF的血清制備 養肺控瘤方購自南通市中醫院中藥房。組成：生黃芪45 g，生曬參15 g，北沙參 30 g，白花蛇舌草 30 g，仙鶴草 30 g，薏苡仁30 g。藥物以等效人劑量的5倍，10倍和15倍煎煮。劑量轉換根據《中藥藥理學實驗方法學（第3版）》提供的方法進行換算。

將雄性SD大鼠隨機分為4組制備含藥血清，分別為對照組、5倍劑量組（5×）、10倍劑量組（10×）和15倍劑量組（15×）。藥物治療組給予YKF 3 g/mL、6 g/mL、9 g/mL（相當于 5倍、10倍和 15倍劑量），對照組給予等量蒸餾水。每組每天以3 mL/次進行2次灌胃（早晨和晚上）。在第6次灌胃后2 h收集血液以制備含YKF的血清。滅活和滅菌后，將血清儲存在冰箱中供以后使用。動物試驗嚴格遵守美國國立衛生研究院《實驗動物護理和使用指南》（NIH Pub.No.85-23，1996修訂），并經南通市中醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養 肺癌A549細胞系從國家認證細胞培養物收藏中心（中國上海）獲得。含有青霉素-鏈霉素的Opti-MEM（Gibco）用于培養細胞。對于含有YKF的血清處理，將A549細胞接種在6孔板中并培養過夜。第2天，將細胞在不同劑量含有10%YKF血清的新鮮完全培養基中培養48 h。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理細胞以干擾自噬體的形成。

1.3 電子顯微鏡檢測自噬 藥物處理48 h后，將細胞消化并重懸于PBS中。細胞用PBS洗滌3次。離心后，沿著管壁加入2.5%戊二醛并在4℃下固定過夜。第2天，用PBS固定細胞并漂洗3次，然后，用1%四氧化鋨在4℃固定30 min。將不同濃度的丙酮連續加入到細胞中進行脫水（順序為50%，70%，90%，100%）。將細胞與稀釋的包埋劑在室溫下混合30 min，并在室溫下用純包埋劑代替過夜。將細胞質量移至膠囊底部并加入包埋溶液的混合物。然后，將它們在60℃的烤箱中烘烤以凝固成一個硬塊。將硬塊切成約1μm厚的半薄切片并用醋酸鈉和檸檬酸鉛染色。在電子顯微鏡下觀察自噬體。當自噬體和溶酶體融合形成自噬體時，它們呈現單層結構。

1.4 mRFP-GFP-LC3慢病毒載體制備和自噬流檢測在293 T細胞中制備pLVX-puro-mRGP-EGFPLC3B慢病毒載體，將293 T細胞接種在培養皿中并培養至80%時傳代。將5μg pLVX-puro-mRGPEGFP-LC3B，5μg psPAX2和 5μg pMD2.G的質粒混合物溶解于600μL opti-MEM中。并制備另一種20μL lipo3 000和600μL opti-MEM的混合物。將2種混合物溶液混合后在室溫下放置20 min，加入細胞培養皿中。細胞培養48 h。收集上清液以獲得慢病毒載體，并用0.45μm過濾器過濾。通過超速離心濃縮慢病毒載體，并用0.22μm過濾器過濾。然后，測量了病毒滴度。為了檢測A549細胞中的自噬流，將對數生長階段的細胞以每孔5×104個細胞接種到24孔板中。接著，將細胞置于細胞培養箱中過夜。第2天，每個孔以MOI=20的病毒量加入新鮮培養液。感染24 h后，去除含有病毒的培養基。共孵育48 h后，將細胞用多聚甲醛固定并密封。用共聚焦顯微鏡觀察綠色斑點和紅色斑點，并以800×拍照。

1.5 細胞轉染 用無菌PBS洗滌對數生長階段的A549細胞1次，并用胰蛋白酶消化。將細胞沉淀重懸于完全培養基中。計數后，將細胞以每孔3×105個/m L接種到6孔板中，并置于細胞培養箱中過夜。第2天，將Si-Beclin-1-1/2/3或siRNA陰性對照（NC）與Lipofectamine 3 000混合，并加入細胞培養液中。將細胞置于細胞培養箱中6 h，然后換成完整的培養基再培養48 h。最后，收集細胞用于進一步試驗。

1.6 實時定量PCR（qRT-PCR） 為了確定Beclin-1 mRNA的表達水平，使用qRT-PCR分析不同方法處理的細胞。用RNAiso Plus（Trizol）加入細胞并充分裂解，并通過光譜儀測定RNA的純度和濃度。使用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TAKARA）將等質量的RNA逆轉錄成cDNA。以ABI ViiA7熒光定量PCR儀中的Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo）擴增系統為基礎，利用cDNA產物進行實時定量擴增。實時定量PCR的引物為：

Beclin-1 mRNA的表達水平相對于GAPDH。

1.7 CCK-8 將每孔以104的細胞接種在96孔板中并置于培養箱中過夜。第2天，將細胞與含有10%YKF血清的完整培養基分別培養24 h、48 h、72 h。孵育時間后，將96孔板的每個孔中加入10 μL CCK-8溶液并再溫育2 h。在450 nm處測量每個孔的吸光度。

1.8 蛋白質印跡 處理過的細胞用PBS洗滌，然后在結冰條件下使用RIPA裂解物（Beyotime，Shanghai，China）裂解30 min。離心后收集的上清液是總蛋白質。基于BSA方法定量每個蛋白質樣品。等質量的蛋白質在SDS-PAGE和電泳分離上加載緩沖中加載。將蛋白質從凝膠上轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白質，并用第一抗體印跡特異性蛋白質。印跡在用Millipore ECL系統孵育第二抗體和化學發光后可視化。第一抗體是anti-Beclin-1，anti-p62，anti-LC3，和 GAPDH（PROTEINTECH）。第二抗體是HRP標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Beyotime）。

1.9 Transwell細胞遷移和侵襲實驗 用胰蛋白酶消化A549對數生長期細胞，并用PBS洗滌。將細胞重懸于無血清培養基上，細胞密度調整至4×105個/m L。將直徑為8μm的Transwell小室置于含有培養基的24孔板中。將200μL細胞懸浮液加入到上層小室中并培養48 h。取出小室并用PBS洗滌，并用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min。細胞用結晶紫染色溶液染成紫色。將帶有細胞的小室置于載玻片上并在顯微鏡下觀察。Transwell分析細胞侵襲能力的方法與上述方法相同除了需要除了在Transwell小室中添加基質膠以及在Transwell上室添加105個細胞外。

1.10 數據處理 試驗數據采用SPSS 21.0進行分析，并用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗統計，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YKF含藥血清促進A549細胞的自噬作用 分別用含5×、10×、15×YKF的血清對A549細胞處理48 h，并評估YKF對細胞活力的影響。見圖1A左。結果顯示：含YKF的血清劑量越高，細胞活力越低，但3組間細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），表明較高劑量的YKF并不具有更好的抑制細胞活性的能力。選擇含有5×YKF的血清對A549細胞處理24 h、48 h、72 h，并進行CCK-8活力測定。見圖1A右。結果顯示：細胞活力隨著處理時間的增加而降低。

圖1 養肺控瘤方（YKF）促進A549細胞自噬

使用蛋白質LC3 II/LC3 I比值來觀察自噬體的形成和自噬情況。為了評估YKF對A549細胞自噬的影響，用含YKF的血清處理A549細胞48 h后，檢測細胞中LC3 II/I比值、p62和Beclin-1的表達。見圖1B。結果顯示，LC3 II/I比值升高，p62和Beclin-1表達水平增加，（P＜0.001）。結果表明：YKF 可能誘導A549細胞的自噬性死亡。

2.2 通過3-MA抑制自噬逆轉YKF對A549細胞的促進自噬作用 選擇含5×YKF的血清處理48 h的A549細胞。并在放大13 000倍的電子顯微鏡下觀察其自噬情況。見圖2A。為了進一步確定YKF的自噬促進作用，我們比較了含5×YKF血清處理的A549細胞用3-MA抑制自噬劑或不用3-MA抑制自噬劑后的LC3斑點。結果顯示，與陰性對照組相比，含5×YKF血清可誘導LC3斑點增加，而這種增加在3-MA處理后消失，表明YKF對A549細胞發揮促進自噬的作用。見圖2B。

圖2 3-M A抑制自噬對YKF誘導的A549細胞自噬的影響

2.3 沉默Beclin-1逆轉了YKF對A549細胞的促進自噬作用 我們通過siRNA干擾質粒轉染敲除A549細胞中的Beclin-1，并檢測其對細胞活力的影響。經si-Beclin1-1、si-Beclin1-2 和 si-Beclin1-3 轉染A549細胞后，僅si-Beclin1-2能誘導Beclin-1下調，（P＜0.01）。因此，在以下試驗中選擇si-Beclin1-2來沉默Beclin-1。見圖3A。沉默Beclin-1降低了YKF誘導的LC3II/I比值和p62表達水平。同樣，3-MA也達到了與沉默Beclin-1相同的效果，抑制了LC3II/I比值和p62的表達水平，表明YKF誘導的A549細胞自噬依賴于Beclin-1。見圖3B。以上結果表明：Beclin-1沉默和3-MA均可逆轉YKF誘導的細胞活力下降（P＜0.001）。見圖3C。

圖3 沉默Beclin-1可逆轉含YKF的血清對A549細胞的自噬促進作用

2.4 沉默Beclin-1逆轉含YKF的血清抑制細胞遷移 為了進一步確定YKF的抗腫瘤特性，研究含YKF血清對A549細胞遷移的影響。結果顯示，與對照組相比，含5×YKF血清導致遷移的細胞數量顯著減少（P＜0.001）。在Beclin-1沉默的A549細胞中加入含5×YKF的血清。與含5×YKF血清和si-Beclin-1陰性對照細胞相比，Beclin-1沉默的A549細胞遷移更多（P＜0.05）。此外，與含5×YKF的血清和si-Beclin-1陰性對照細胞相比，自噬抑制劑3-MA處理的A549細胞遷移更多（P＜0.01）。這些數據表明，YKF通過影響自噬和Beclin-1來抑制A549細胞遷移。見圖4。

圖4 沉默Beclin-1逆轉含YKF的血清抑制A 549細胞遷移

2.5 沉默Beclin-1逆轉含有YKF的血清對細胞侵襲的抑制作用 通過沉默Beclin-1逆轉含YKF的血清以抑制A549細胞侵襲。結果顯示，與空白組相比，含5×YKF的血清導致侵襲細胞數量顯著減少（P＜0.001）。將含5×YKF的血清添加到Beclin-1沉默的A549細胞中。與5×YKF的血清和si-Beclin-1的陰性對照細胞相比，Beclin-1沉默的A549細胞侵襲性更強（P＜0.05）。此外，與含5×YKF的血清和si-Beclin-1的陰性對照細胞相比，3-MA處理的A549細胞侵襲性更強（P＜0.01）。這些數據表明，YKF通過影響自噬和Beclin-1來抑制A549細胞侵襲。見圖5。

圖5 沉默Beclin-1逆轉含YKF的血清以抑制A549細胞侵襲

3 討論

近幾十年來，許多形式的補充醫學和替代醫學在世界范圍內得到了廣泛應用，在改善癌癥患者的生活質量方面發揮了作用[18]。在中國，中醫藥被廣泛接受，并成為有益于癌癥患者補充療法和替代療法的重要手段[6]。許多抗癌中藥方劑已應用于臨床，并對癌癥患者產生了有益的效果。中草藥治療非小細胞性肺癌的Meta分析表明，中草藥可以有效提高患者生存質量和延長生存期，在療效、安全性和控制成本方面均具有顯著的優勢[19-20]。本研究作為以細胞試驗為主的基礎研究，證實了YKF在促進肺癌細胞A549自噬、抑制肺癌細胞活力、遷移、侵襲等方面可發揮重要作用。

自噬在腫瘤存活或細胞死亡中具有復雜的雙重作用[1]。調控自噬是否有利于消除癌癥目前尚不清楚。許多研究表明天然藥物或藥物成分可以誘導癌細胞的自噬性死亡，如丹參酮[21]，堪非醇[3]和重樓皂苷VI[22]。許多中國傳統藥物或草藥提取物可誘導肺癌細胞自噬性死亡[23-25]。本研究結果顯示：YKF可抑制腫瘤細胞活力，促進A549細胞中自噬相關蛋白（Beclin-1、p62和LC3 II/I）的表達和自噬體的形成，進一步證實YKF可誘導A549細胞的自噬性死亡。同時，YKF對A549細胞可發揮抗細胞遷移和侵襲的作用。綜合來看，YKF對A549細胞能夠起到有效的抗腫瘤活性的作用。

惡性細胞常常會表現出自噬缺陷和自噬相關蛋白的異常模式。Beclin-1作為自噬的核心蛋白，顯示出異常的表達模式和/或活性，這些異常與致癌作用呈正相關或負相關[26-28]。文獻報道，基于小鼠Beclin-1基因敲除的研究[29]表明Beclin-1的雜合破壞導致體內細胞增殖增加和自噬減少，并表明Beclin-1或其他自噬基因的突變可能有助于人類癌癥的發病機制。例如，有研究發現Beclin-1在胰腺癌和前列腺癌癥等癌癥患者中表達下調[30-31]。此外，具有抗癌特性的藥物對Beclin-1的抑制作用有利于癌癥細胞的去除[32]。本研究發現在含YKF血清誘導的A549細胞活力下降和自噬增加的情況下，Beclin-1的表達水平顯著提高，而基因敲除抑制了YKF對A549細胞LC3 II/I比值、p62表達、遷移和侵襲的影響。由此，我們可以推斷，Beclin-1是YKF誘導細胞自噬、抑制A549細胞遷移和侵襲的抗癌特性中的一個關鍵性分子。

綜上所述，本研究發現：YKF對肺癌A549細胞具有很強的抗癌作用。此外，A549細胞的Beclin-1依賴性自噬死亡是YKF抑制肺癌進展的機制。本研究基于傳統處方YKF進行的基礎試驗來闡明抗癌藥物YKF的作用機制，以期在未來的腫瘤治療中提供更多科學依據和思路。