基于網絡藥理學探討獨活-羌活-細辛治療膝骨關節炎的作用機制*

盧 鈺 ，保超宇 ，李具寶 ，尹本敬 ，劉 暢 ，邱榮能 ，潘斯學 ，何光雄 ，向俊宜 △

（1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021；3.云南省第一人民醫院，云南 昆明 650032）

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的膝關節退變性疾病，病理基礎為關節軟骨的退變和磨損、滑膜等關節結構的病變，導致關節的疼痛、變形及功能障礙[1-2]。隨著我國老齡化社會的到來，其發病率逐年上升，需要手術的患者也越來越多，給社會帶來巨大的負擔[3-5]。中醫藥在治療KOA方面具有獨特的優勢，且治療方法多樣[6-7]。通過中藥外敷內服、針灸、藥物注射、功能鍛煉、減輕體重等措施對KOA患者進行保守治療，對減輕患者臨床癥狀、降低手術率具有重要意義[8]。我國傳統中醫藥在KOA治療方面具有悠久的歷史和良好的療效，其中本院的骨痹合劑在多年的KOA臨床使用中獲得了滿意的療效[9-10]，但是其作用機制尚不明確。骨痹合劑含有多種中藥成分，其中的活性物質更是種類繁多。骨痹合劑具有補肝腎、強筋骨、祛風勝濕、散寒止痛、通筋活絡等多種功效，其中獨活-羌活-細辛藥物組合在骨痹合劑中起著祛風勝濕、散寒止痛的作用。據文獻報道，獨活、羌活、細辛均顯示抗炎鎮痛的作用，其中，細辛可通過抑制炎癥介質釋放、降低毛細血管通透性等環節發揮抗炎作用[11]，獨活、羌活也顯示抗炎鎮痛的作用[12]。獨活、羌活、細辛常被用于治療KOA，在多個方劑中均有使用，但這3味中藥及其合用后對于KOA的治療機制目前尚不明確。

網絡藥理學是基于系統生物學、多向藥理學、計算生物學、數據庫等多學科技術，通過高通量成分篩選、分子交換驗證、結合網絡分析等技術，分析藥物與疾病之間互作關系的新興學科，可以闡明藥物的作用機制，預測其作用靶點、通路，還可用于方劑的驗證、新藥的研發設計[13-14]。該技術將“藥物-靶點-疾病”之間的線性關系更替為“藥物-多個活性成分-多個靶點-疾病”的網絡關系，其具有的系統性和整體性與中醫藥的多種藥物、多種有效成分完美匹配，為中醫藥的研究提供了更科學、更全面的新方法。本研究以網絡藥理學為基礎，通過多個數據庫的數據收集、特定軟件進行數據分析，系統、全面地分析骨痹合劑中重要成分獨活-羌活-細辛在治療KOA中的作用機制，篩選和預測其中的關鍵靶點和通路，以明確骨痹合劑治療KOA的部分作用。

1 資料與方法

1.1 成分靶點信息查詢 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺 TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索并獲得羌活、獨活、細辛的活性成分和靶點，所有成分的篩選條件設置為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18。

1.2 疾病靶點查找 以“knee osteoarthritis”為關鍵詞，在 GeneCards（https：//www.genecards.org/），NCBI基因數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）進行人類基因檢索，找出KOA已知的相關靶基因。

1.3 篩選共同靶點并構建PPI網絡 將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到92個共有靶點，作為藥物作用于疾病的預測靶點進行進一步的通路富集分析。將藥物疾病共有靶點輸入 String 數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進行PPI網絡的構建，將生物種類設定為“Homo sapiens”，得到 PPI網絡。

1.4 網絡合并 為了更好地理解中藥、成分、疾病以及相應靶點之間的復雜相互作用關系，以對應的中藥、成分、治療疾病以及作用靶點為基礎，構建了成分-疾病-靶點網絡圖，導入Cytoscape 3.8.0中進行網絡圖的繪制，并同時繪制中藥-成分-疾病-通路-靶點網絡圖，以便更直觀地展示中藥活性成分在治療KOA過程中的多成分、多靶點的作用特點。

1.5 拓撲分析 將PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以degree、betweenness centrality、average shortest path length和closeness centrality這四個參數為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關鍵靶點。

1.6 MCODE聚類分析 本研究通過MCODE分析進行關鍵基因的篩選。將已經構建好的PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0中，打開MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。具體結果見聚類分析文件夾。

1.7 關鍵成分篩選 將成分-疾病-靶點網絡圖，導入Cytoscape 3.8.0中進行拓撲分析。將成分進行degree排序，選取大于平均度值的成分作為關鍵活性成分。

1.8 GO富集分析和KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cell component，CC）富集，引用 String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，將富集的結果導入R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數據庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，將富集的結果導入R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler包后，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

2 結果

2.1 活性成分 羌活獲得17個有效成分，52個靶點；獨活獲得11個有效成分，49個靶點；細辛獲得8個有效成分，104個靶點。

2.2 疾病靶點篩選 經檢索，在GeneCards數據庫檢索到2 040條相關基因，NCBI數據庫獲得148個基因，CTD數據庫獲得4 594個靶點。將這3個數據庫的基因合并刪重之后，得到5 768個KOA相關基因。

2.3 韋恩圖及PPI網絡 繪制出的韋恩圖顯示，藥物、疾病共同靶點92個，見圖1。得到的PPI網絡圖中有92個節點，738條邊，平均度值為16。圖2為string網站導出的PPI網絡圖，圖3為Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖。圖3中的節點顏色和大小根據度值調整，節點越大、顏色越深，則度值越大，線從粗到細表示edge betweenness從大到小。

圖1 韋恩圖

圖2 String網站導出的蛋白相互作用關系網絡圖

圖3 Cytoscape軟件繪制的蛋白相互作用關系網絡圖

2.4 網絡合并 以納入的對應的中藥、成分、治療疾病以及作用靶點為基礎，通過Cytoscape 3.8.0進行網絡繪制，以便進一步地理解中藥-成分-疾病-通路-靶點之間的關系，分別得到中藥-成分-疾病靶點網絡（圖4）和中藥-成分-疾病-通路-靶點網絡（圖5）。

圖4 中藥-成分-疾病靶點網絡圖

圖5 中藥-成分-疾病-通路-靶點網絡圖

2.5 拓撲分析和MCODE聚類分析 根據得到的PPI網絡圖，進行進一步分析。通過拓撲分析，總共篩選出36個關鍵靶點，將前20個靶點使用R 3.6.3進行圖片繪制，橫坐標為每個靶點的度值（圖6）。通過聚類分析總共得到5個基因簇和4個核心基因，核心基因為 NOS3，ESR1，ACOX1 和 NR1I2（表1）。

表1 MCODE聚類分析得到的核心基因簇

圖6 拓撲分析得出的關鍵靶點

2.6 關鍵成分篩選 通過將成分進行degree排序，得到8個關鍵成分（表2）。

表2 關鍵成分信息表

2.7 GO富集分析和KEGG通路富集 GO富集總共富集到1 254條生物過程，129項分子功能相關，59項細胞組成相關，將其繪制成柱狀圖（圖7）和氣泡圖（圖 ）。

圖7 GO富集柱狀圖

圖8 GO富集氣泡圖

KEGG富集總共富集到126條信號通路，繪制柱狀圖（圖9）和氣泡圖（圖10）。

圖9 KEGG富集柱狀圖

圖10 KEGG富集氣泡圖

3 討論

膝骨關節炎屬于中醫“痹證”的范疇，由于年老體虛、正氣不足、反復勞損，致肝腎精血虧損，加之復感風寒濕外邪，痹阻經絡日久，氣血運行不暢所致[15]。獨活-羌活-細辛藥物組合的應用已有千年歷史，常用于治療膝骨關節炎，具有祛風除濕、散寒止痛之功效[16]。目前獨活中的部分化合物已有相關KOA的研究報道，其中，二氫歐芹素具有較強的鎮痛和抗炎活性[17]，二氫歐芹醇能通過抑制NF-κB等途徑來抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、組胺等物質的釋放來達到抗炎、鎮痛作用[18]，香柑內酯能提高堿性磷酸酶的活性，促進I型膠原合成[19]；細辛、羌活也同樣具有類似的抗炎、鎮痛作用[20-21]。其中，細辛中的有效成分——槲皮素能有效抑制關節軟骨破壞及關節滑液中IL-1β、TNF-α的水平[22]，進一步研究還發現，槲皮素可通過抑制p38MAPK通路相關因子表達而降低骨關節炎中的炎性因子表達，保護關節軟骨[23]。而羌活中的4-methyl-3-trans-hexenylferulate、（－）-bornylferulate、4-methoxyphenethylferulate、phenethyl-ferulate能顯著抑制NO分泌[24]，此外羌活中部分多炔類成分也表現出顯著抑制NO分泌的作用[25]。因此，羌活具有抗炎能力，被廣泛應用于骨關節炎的治療中。但是由于中藥成分復雜，作用于多個靶點、影響多個生物信號通路，并且不同藥物之間還存在相互作用，所以目前的研究依然存在一定的局限性，并不能完全闡明中藥治療疾病的作用機制。

網絡藥理學利用日益健全的多個網絡數據庫，建立“中藥-成分-靶點”與“疾病-基因-靶點”兩個網絡，通過相同靶點將兩個網絡進行映射、關聯，從而找出疾病與藥物成分之間的共同靶點，達到預測中藥治療疾病機制的目的。相較于既往采用實驗驗證藥物作用機制的方法，網絡藥理學具有低成本、可重復的特點，并且網絡藥理學具有更為大量的樣本量、更加全面，與中藥成分的多樣性更加適配，可作為后期實驗研究的重要鋪墊，減少實驗驗證的盲目性。

本研究通過數據挖掘，揭示獨活-羌活-細辛有山柰酚、β-谷甾醇、芝麻脂素、異紫花前胡苷、紫花前胡苷、O-乙酰二氫歐山芹酯等關鍵成分，這些成分具有抗氧化、抗炎、鎮痛等作用。獨活-羌活-細辛與膝骨關節之間存在92個共有靶點，通過建立中藥-成分-疾病靶點網絡以及中藥-成分-疾病-通路-靶點網絡圖，更直觀地反映獨活-羌活-細辛藥物組合在治療KOA的復雜作用機制。

通過Cytoscape進行拓撲分析，發現AKT1、ESR1、JUN、CASP3等為關鍵靶點，其中多項研究表明AKT1可以增加骨關節炎軟骨細胞增殖并且抑制其凋亡，是骨關節炎的治療的重要靶點[26]，由此延伸出許多針對AKT1靶點基因的研究[27]；JUN蛋白在骨關節炎患者體內的表達顯著升高，抑制B細胞活化轉錄因子/JUN的轉錄活性，減少MMP的表達，減輕OA小鼠的軟骨細胞損傷[28]；ESR1同樣能抑制軟骨細胞凋亡，促進軟骨細胞增殖[29]；CASP3在膝骨關節炎患者中表達顯著增加，與軟骨細胞凋亡有關[30]。

MCODE聚類分析找出了其中的核心基因NOS3、ESR1、ACOX1、NR1I2。XbaI和 PvuII限制酶識別位點在ESR1基因中的多態性與多種疾病有關，其中包括骨關節炎[31]，進一步的研究認為ESR1中rs2234693的多態性與KOA的發生存在相關性[32]；NR1I2可以激活p16-CDK 4/6-pRb-E2F信號通路，減輕軟骨細胞的氧化應激和細胞衰老，從而達到治療膝骨關節的目的[33]；目前部分研究認為ACOX1與肝細胞內脂肪沉積和某些癌癥具有相關性，但是缺乏ACOX1與膝骨關節炎的相關研究[34]；有研究認為NOS3與阿爾茨海默病、高血壓、腦卒中等多種疾病相關，缺乏研究證明NOS3與膝骨關節炎存在相關性，甚至有研究認為NOS3與骨關節炎之間并沒有相關性[35]。對此情況，筆者認為，網絡藥理學也存在其不足之處，可能導致了本次研究結果的偏頗，但是ACOX1、NOS3也可能是膝骨關節炎的相關基因，只是目前尚未明確，這也為未來的研究提供了新的方向。

通過GO富集分析進一步確定了獨活-羌活-細辛可能起作用的生物過程、信號通路、分子功能、細胞組分，其中主要有類固醇激素反應性、脂多糖反應性、脂肪酸代謝過程、活性氧代謝過程、對細菌分子、藥物、抗生素反應性以及對異物來源的反應及細胞反應，提示獨活-羌活-細辛可能通過調節這些生物過程來治療膝骨關節炎。有研究認為類固醇激素水平可能與男性全膝、全髖關節置換術存在相關性[36]，但是目前的研究還不能準確闡明其機制和相關性[37]；脂多糖可以誘導軟骨細胞的凋亡，促進骨關節炎的發生，而抑制脂多糖可以減少軟骨細胞的凋亡[38]；脂肪酸代謝過程也與骨關節炎存在相關性，不飽和脂肪酸可能對預防骨關節炎有益，而飽和脂肪酸則相反[39]；關節內的氧化應激和活性氧過高會導致軟骨細胞衰老和凋亡，細胞外基質合成和降解以及滑膜炎癥和軟骨下骨功能障礙[40]。其余生物過程也有部分已經被證明與膝骨關節炎密切相關，也有部分缺乏相關研究。

KEGG通路富集的結果中，主要有AGE-RAGE通路和TNF通路。AGE-RAGE通過引起軟骨基質降解與軟骨細胞凋亡以及促進軟骨及滑膜組織的炎性反應等方式在OA發病中發揮重要作用，并且通過抑制AGE-RAGE通路可以明顯減緩骨關節炎病程發展[41]。TNF作為重要的炎癥因子，介導多種炎癥反應，在骨關節炎的發展中至關重要[42]。

本研究基于網絡藥理學的方法，從分子生物學的角度證明了骨痹合劑治療膝骨關節炎的有效性，初步預測了獨活-羌活-細辛治療膝骨關節炎的有效化學成分，可能的信號通路、生物過程、核心基因，為后續獨活-羌活-細辛治療膝骨關節炎有效成分的分析和作用機制探索提供了參考方向和依據。