微小RNA-141靶向表皮生長因子受體調控乳腺癌上皮間質轉化的作用機制研究

王 婧, 周 蓓, 吳 忠, 吳沉昊

(海南省婦女兒童醫學中心 乳腺外科, 海南 海口, 570206)

研究[1]顯示乳腺癌占全球女性浸潤性癌癥的22.9%, 每年約有425 000名女性死于乳腺癌。更為嚴峻的是，每年有35 000名女性死于乳腺癌侵襲和轉移，這是因為癌細胞可以通過血液擴散到全身，導致病情進一步惡化[2-3]。根據定義乳腺癌表型和預測治療反應的分子標志物，可以將乳腺癌分為不同的亞型，包括管腔亞型和基底亞型，其中基底亞型是癌細胞中侵襲性最強的，腫瘤轉移率高，患者存活率較低[4-5]。上皮細胞間質轉化(EMT)是指通過特定的程序將上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[6]。研究[7]發現EMT異常激活與加速各種癌癥的進展有關。研究[8-9]表明, EMT是惡性腫瘤發生和轉移的基礎，是源自上皮細胞的惡性細胞遷移和侵襲的重要生物學過程。研究[10]表明，表皮生長因子受體(EGFR)的表達與乳腺癌的發生和預后有關。研究[11-12]報道在三陰性乳腺癌患者中可觀察到EGFR的遺傳改變，并可被視為乳腺癌腦轉移的潛在生物標志物。本研究探討EGFR在乳腺癌中的作用及其上游調控機制，為乳腺癌早期生物標志物的篩選及靶向治療提供依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月—2017年10月本院收集的60份腫瘤組織和癌旁正常組織樣本(距離腫瘤組織>5 cm)。納入標準: ① 經2名以上病理學家確診者; ② 患者均未進行術前或術后藥物治療; ③ 患者無其他惡性疾病或腫瘤; ④ 患者依從性良好。排除標準: ① 男性乳腺癌患者; ② 合并其他惡性疾病或腫瘤者; ③ 接受過相關干預治療者; ④ 依從性較差的患者。所有樣本取出后迅速轉移到液氮中保存并貯存在-80 ℃冰箱中。所有納入患者均對本研究知情同意。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過(審批號: 2022倫申第1號)。

1.2 細胞系和細胞培養

人乳腺纖維細胞系(Hs578Bst)和3種人乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231和 MDA-MB-435)均購自北納生物。人乳腺細胞系Hs578Bst在90%的DMEM培養基和10%的胎牛血清(FBS)中培養。MCF-7和MDA-MB-231在90%的DMEM和10% FBS組成的CM1-1培養基中培養。人乳腺癌細胞MDA-MB-435在90%的L15和10%的FBS中培養。細胞在37 ℃、5% CO2的潮濕環境中生長。

1.3 微陣列分析

使用癌癥基因組圖譜計劃(TCGA)數據分析癌旁組織和乳腺癌組織之間的前20個差異表達基因。篩選標準為log2(倍數變化)mRNAs>1和P<0.05。

1.4 加權基因共表達網絡分析(WGCNA)

WGCNA R軟件包用于在共表達網絡中收集多組強共表達基因。使用加權基因共表達網絡重建算法創建共表達網絡。差異表達數據預處理后，去掉所有樣本中表達量都很低的基因，去掉所有樣本中表達量幾乎沒有差異的基因，可用sd篩選，但不建議只保留差異基因。構建相關性矩陣，相關系數范圍是-1～1, 而后構建拓撲重疊矩陣，對基因進行聚類，每條線代表1個基因，相似的基因被聚到1個分支。

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測

通過Targetscan和Miranda預測微小RNA-141(miR-141)的靶基因，然后使用雙熒光素酶報告基因檢測證明miR-141與靶基因之間的靶向關系。Dual-Luciferase Reporter System(Progema, 美國)用于測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性的熒光素酶活性。根據制造商的說明，在Lipofectamie 2000 (Invitrogen, 美國)基礎上應用miR-141模擬物或miR-141 NC轉染含有EGFR 3′UTR-WT或EGFR 3′UTR-MUT的psi-CHECK2 載體或psi-CHECK2。所有寡核苷酸均購自Sangon Biotech(中國上海)。

1.6 細胞轉染

將購自Genepharma(中國上海)的miR-141模擬物、miR-141抑制劑、pcDNA3.1-EGFR 重組質粒和miRNA對照轉染到MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞中。轉染前1 d, 將處于對數期的MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞(5×104/mL)接種到12孔板中。第2天，當細胞達到約80%匯合時，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染細胞。轉染效率通過實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)測試進行評估。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據制造商的說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen)從組織或細胞系中提取總RNA。根據制造商的說明，使用多合一TM miRNA qRT-PCR檢測試劑盒制備提取的RNA。HiScipt Ⅱ (Vazyme，China)用于合成cDNA。使用AB7300 thrmo-recycler (Applied Biosystems, USA)進行qRT-PCR, 相關的EGFR、GAPDH、miR-141和U6的引物序列見表1。GAPDH和U6分別作為EGFR和miR-141檢測的內參基因。通過2-△△ct計算EGFR和miR-141的相對表達水平，每個實驗獨立進行3次。

表1 qRT-PCR相關的引物序列

1.8 細胞增殖試驗

使用Cell Counting Kit-8(CCK-8系統, Dojindo, 日本)評估細胞增殖能力。轉染后，將細胞接種于96孔板(每孔密度為2×103個細胞)，并通過CCK-8系統記錄細胞增殖情況，每24 h記錄1次，持續3 d。使用酶標儀在450 nm處檢測光密度值。

1.9 Transwell實驗

使用24孔Transwell小室(Corning, NY, USA)評價乳腺癌細胞遷移能力。在Transwell上室加入200 μL乳腺癌細胞懸液(1×105個細胞); 在下室添加600 μL含有1% FBS的RPMI-1640培養基; 24 h后，將遷移到下表面的乳腺癌細胞用無水乙醇固定10 min, 然后用0.5%結晶紫染色10 min。在顯微鏡(Olympus，日本)下放大200倍觀察染色的細胞。

1.10 BrdU增殖情況檢測

BrdU標記細胞完成后，去除培養液，并加入1 mL 4%的多聚甲醛，室溫固定15 min后，每孔加入1 mL含0.3% TritonX-100的PBS，室溫孵育15 min。每孔加入0.5 mL Click反應液，輕輕搖晃培養板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。室溫避光孵育30 min, 吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次。1×Hoechst 33342溶液的配制: 按1∶1 000比例用PBS稀釋Hoechst 33342。吸除洗滌液后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1 mL, 室溫避光孵育10 min。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.11 蛋白質印跡分析

使用RIPA裂解緩沖液裂解轉染后的乳腺癌細胞。使用BCA蛋白質檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)測量細胞裂解物的蛋白質濃度。等量蛋白樣品經SDS-PAGE分離后電轉至PVDF膜(Millipore, 德國), 5%脫脂奶粉室溫密封2 h, 然后用原代培養抗體4 ℃過夜。一抗包括抗波形蛋白(Santa Cruz, CA，USA; 1∶5 000)、抗E-cadherin(Santa Cruz; 1∶5 000)、抗EGFR(Santa Cruz; 1∶5 000)和抗GAPDH(Santa Cruz; 1∶5 000)。使用辣根過氧化物酶(HRP)滯后的二抗在室溫下孵育膜1 h。掃描印跡并使用Quantity One成像軟件(Bio-Rad, 美國)測量條帶密度。

1.12 裸鼠皮下移植實驗

取對數生長期的MDA-MB-231細胞，制備單細胞懸液計數，按2×105個/只分別接種于BALB/c裸鼠背部左側或右側皮下，每組6只裸鼠, 4周后處死裸鼠，觀察成瘤情況。

1.13 統計學分析

采用GraphPad 7.0(GraphPad Software, 美國)進行統計分析。經正態檢驗后，滿足正態分布的數據以平均值±標準偏差的形式表示, 2組間比較分析采用t檢驗，多組比較分析采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGFR在乳腺癌組織和細胞中的表達情況

應用TCGA數據庫分析乳腺癌基因表達情況。在乳腺癌細胞中，差異表達前20個基因組的熱圖顯示，含有EGFR的基因組在乳腺癌細胞中的表達上調(圖1A)。根據其在乳腺癌中的表達，基因組被分為不同的模塊，每個模塊用不同的顏色表示(圖1B)。不同模塊中基因組的統計分析通過Z-summary進行評估，其中模塊的Z-summary>0表示該模塊在乳腺癌細胞中高表達(圖1C)。每個基因塊都由PLotMA映射，并分別在12個模塊中選擇特定的中心基因(圖1D)。結合其他文獻，初步篩選出棕色模塊中的EGFR基因。此外，使用基于STRING數據庫的Cytoscape有助于建立棕色模塊中所有基因的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡，最終確定EGFR的核心位置(圖1E)。

應用qRT-PCR檢測miR-141和EGFR在乳腺癌組織或細胞中的表達，結果表明, miR-141在癌組織中表達降低，而EGFR在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05); miR-141在3種乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435 )中的表達低于正常乳腺細胞系(Hs 578Bst), 而EGFR在3種乳腺癌細胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435)中表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

A: 倍數變化>2的前20個基因組差異表達的熱圖,紅色代表上調,綠色代表下調; B: 基于相異性測量聚類的所有差異表達基因的樹狀圖; C: 基于相異性度量聚類的所有差異表達基因的氣泡圖; D: 12個模塊中模塊特征基因的散點圖; E: 棕色模塊中基因的PPI網絡,每個節點的顏色強度與加權基因共表達網絡中的連接程度呈正比,紅色為正相關,綠色為負相關。圖1 乳腺癌中EGFR的表達情況

2.2 miR-141與EGFR的靶向關系驗證

本研究通過HMDD數據庫找出了578個與乳腺癌相關的miRNA, 共篩選出34個靶向EGFR的上游miRNA。韋恩圖顯示有20個重疊的miRNA, 最終選擇了miR-141作為上游miRNA進行研究(圖3A)。雙熒光素酶報告基因檢測表明，轉染miR-141模擬物后, EGFR-WT 組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05), 含有相同片段突變序列的EGFR-MUT組的熒光素酶活性在轉染后幾乎保持不變(圖3B)。結果表明,EGFR是miR-141的靶基因。本研究進一步驗證了miR-141過表達及抑制模型的構建情況，結果提示miR-141模擬物顯著增高了miR-141的表達(P<0.05), 而miR-141抑制劑則顯著抑制了miR-141的表達(圖3C)。進一步檢測發現, miR-141過表達能夠顯著抑制EGFR的表達(P<0.05), 而miR-141受抑制則能夠顯著增高EGFR的表達(圖3D)。

2.3 miR-141和EGFR在調控細胞遷移、增殖及EMT進程中的作用

本研究同時構建了miR-141和EGFR的干預模型,EGFRmRNA檢測結果顯示, miR-141模擬物組EGFR表達水平降低, miR-141抑制劑組EGFR升高，但miR-141模擬物+EGFR組的EGFR表達上調被逆轉，差異有統計學意義(P<0.05); 蛋白質表達檢測中也發現了相似的結果。上述結果表明miR-141靶向EGFR, 并且EGFR在乳腺癌中的表達受到miR-141的調節。見圖4。

Transwell實驗結果顯示, miR-141過表達能夠顯著降低細胞遷移能力，但miR-141抑制劑和EGFR過表達則能顯著增強細胞遷移能力(P<0.05); 此外, miR-141模擬物+EGFR組細胞遷移數與空白組無顯著差異(P>0.05)。細胞增殖能力檢測顯示，與空白組相比, EGFR組和miR-141抑制劑組的增殖能力增強，而miR-141過表達組的增殖能力下降。此外，模擬物+EGFR組中miR-141和EGFR的共同過表達顯著減輕了EGFR誘導的增殖能力增強的現象(P<0.05), 這一結果在BrdU免疫熒光檢測中同樣得到了證實。見圖5。此外，蛋白質印跡分析顯示，在miR-141過表達細胞中, E-cadherin表達顯著增加而Vimentin表達減少。相反，在EGFR 過表達細胞和miR-141抑制細胞中則觀察到E-cadherin表達顯著降低和Vimentin表達顯著增加。EGFR過表達能夠顯著逆轉miR-141抑制的EMT進程(P<0.05), 見圖6。

A: 在2種人乳腺癌細胞系中調節miR-141或EGFR表達后,通過qRT-PCR檢測EGFR的表達; B: 在2種人乳腺癌細胞系中調節miR-141或EGFR表達后,通過蛋白質印跡法檢測EGFR蛋白的表達。圖4 EGFR在乳腺癌細胞中受miR-141調控

A、B: 通過Transwell實驗檢測miR-141或EGFR表達調控的細胞的遷移能力; C、D: 通過CCK-8法檢測在0、24、48、72 h調節miR-141或EGFR表達后MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞的增殖情況; E、F: 通過BrdU法檢測在72 h時miR-141或EGFR表達后MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞的增殖情況。圖5 miR-141的下調或EGFR的上調可促進細胞遷移和細胞增殖

2.4 miR-141對裸鼠體內成瘤的調控作用

生長曲線顯示, miR-141模擬物組腫瘤的體積顯著小于空白組(P<0.001); miR-141模擬物組腫瘤質量顯著小于空白組(P<0.05); qRT-PCR結果顯示, miR-141過表達后, EGFR表達顯著下降(P<0.05), 而抑制miR-144的表達后EGFR顯著上升(P<0.05); 免疫組化檢測發現, miR-141模擬物組的陽性細胞率顯著低于空白組(P<0.05), 說明miR-141對腫瘤有抑制作用。見圖7。

3 討 論

EGFR表達的改變與許多惡性腫瘤的發病機制和預后密切相關[13]。在乳腺癌患者中，經常觀察到EGFR基因表達升高。有研究[14]鑒定并驗證了3種miRNA(miR-124、miR-147和miR-193a-3p)作為腫瘤抑制因子通過靶向EGFR調控細胞周期并抑制乳腺癌的進程。高EGFR表達是三陰性乳腺癌的獨立預后因素，而本研究發現EGFR表達在乳腺癌組織和細胞中上調并促進乳腺癌增殖和EMT進程。

近年來，已在多種人類癌癥中觀察到miRNA的異常表達。研究[15-16]表明, miR-141通過直接靶向乳腺癌基因來影響EMT、癌細胞遷移、腫瘤生長和轉移。研究[17]報道, SerpinB2促進了miR-200c/141簇的過表達并誘導了乳腺癌細胞的轉移。研究[18]顯示miR-141在乳腺癌中受FOXP3-KAT2B軸調控，并與腫瘤轉移有關。其中轉移性乳腺癌患者血漿中miR-141和miR-200c的表達水平高于非轉移性乳腺癌患者。本研究提出miR-141作為一種抗癌基因，靶向EGFR并且miR-141的過表達可以抑制乳腺癌中的細胞遷移和增殖。本研究通過生物信息學分析篩選并驗證在乳腺癌細胞和組織中EGFR表達上調，并結合HDMM數據庫、Targetscan和miranda網站聯合分析并選擇miR-141作為EFGR的上游調控分子進行驗證。本研究進一步通過qRT-PCR證實了miR-141在乳腺癌組織和細胞中低表達。雙熒光素酶報告基因檢測進一步驗證了miR-141和EGFR之間的靶向關系。Transwell檢測和CCK-8檢測表明miR-141的下調或EGFR的上調可促進細胞遷移和細胞增殖，而miR-141過表達抑制細胞遷移和細胞增殖。此外，蛋白質印跡分析表明EGFR過表達或miR-141抑制可以促進EMT的進程。

綜上所述，本研究有助于理解miR-141通過靶向EGFR介導乳腺癌的進展。EGFR和miR-141表達都可能作為未來預后的預測因素，而miR-141/EGFR軸可能是乳腺癌靶向治療的潛在靶點。