p53、p16、細胞周期蛋白D1、E-鈣黏蛋白在脂肪肉瘤中的表達及意義

寇天雷, 何 軒, 朱金磊, 孫書磊, 劉繼堯, 鄭淑芳

(中國人民武裝警察部隊特色醫學中心 病理科, 天津, 300162)

脂肪肉瘤是一種由分化程度及異型程度不同的脂肪細胞組成的常見軟組織惡性腫瘤，約占軟組織肉瘤的1/5[1]。脂肪肉瘤多發生于下肢深部軟組織與腹膜后，無特殊癥狀和體征，起病隱匿，緩慢性生長，患者往往在發現巨大腫塊后才到院診治。脂肪肉瘤的臨床治療方式主要為手術切除，但手術難以將其完整切除，復發率高，患者常被迫進行多次手術，最終可致死[2]。因此，尋找有效的靶向基因治療方法對于改善脂肪肉瘤患者的預后極為重要。p53是多種惡性腫瘤的獨立預后因素[3], p16是特異的細胞周期抑制劑，細胞周期失控是癌變的重要病因，細胞周期蛋白D1(cyclinD1)作為細胞周期調控因子參與腫瘤的發生與發展，而p53與p16可調控cyclinD1的表達[4]。另外，惡性腫瘤細胞的分化、浸潤與轉移是腫瘤細胞與外環境相互作用的結果，具體體現在控制細胞移動及細胞轉歸的E-鈣黏蛋白(E-cad)表達與功能異常[5]。本研究采用免疫組織化學法檢測p53、p16、cyclinD1、E-cad蛋白在脂肪肉瘤中的表達情況，并探討這4種蛋白表達與脂肪肉瘤患者臨床病理特征及預后的關系，以期為脂肪肉瘤的診治及預后評估提供參考，現報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

將中國人民武裝警察部隊特色醫學中心病理科2009—2016年收治的42例確診脂肪肉瘤的患者作為研究對象，收集患者手術切除的肉瘤組織及肉瘤旁組織。納入標準: ① 經病理檢查確診脂肪瘤者; ② 手術前意識清晰，病情穩定，配合治療者; ③ 無嚴重心、肝、腎和腦功能障礙者。排除標準: ① 資料不全，不配合治療，隨訪信息不完整者; ② 合并其他良惡性腫瘤者; ③ 妊娠期或哺乳期女性。42例脂肪肉瘤患者中，男18例，女24例; 年齡26～80歲，平均(55.57±14.68)歲; 肉瘤最大徑3.0～25.0 cm, 平均(11.64±5.39) cm; 肉瘤部位為四肢18例，軀干24例; 臨床TNM分期為Ⅱ期11例、Ⅲ期22例、Ⅳ期9例; 病理類型為黏液型17例、多形型15例、去分化型10例; 多發病灶6例，單發病灶36例; 局部復發5例，無復發37例; 遠處轉移5例，無轉移37例。本研究經醫院醫學倫理委員會審查批準。

1.2 病理檢測方法

取手術獲得的不同病理類型的脂肪肉瘤組織及肉瘤旁組織，將組織置于10%中性福爾馬林固定48 h, 梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋, 4 μm厚度切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學檢測方法

采用免疫組織化學PV-6000兩步法染色，取“1.2”項所得切片常規脫蠟水化，微波加熱，滴加一抗, 4 ℃過夜，滴加二抗, DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明封固。采用已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

按陽性染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。染色強度評分: 0分為無色, 1分為淺黃色, 2分為棕黃色, 3分為深棕黃色或褐色。陽性細胞所占百分比評分: 0分為陰性, 1分為1%～25%, 2分為>25%～50%, 3分為>50%～75%, 4分為>75%。積分=染色強度評分+陽性細胞占比評分，積分0～1分為陰性，積分≥2分為陽性。每張切片由2名病理科醫師以雙盲法獨立判斷結果。鼠抗人p53、p16、cyclinD1和E-cad單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件分析數據，計數資料進行χ2檢驗，不同蛋白表達的生存分析采用Log-rank分析，生存曲線采用GraphPad Prism 8.0制作。檢驗水準α=0.05, 雙側檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同病理類型脂肪肉瘤組織的HE染色結果

黏液型脂肪肉瘤: 肉瘤具有明顯的黏液背景，可見薄壁的分枝狀(雞爪樣)血管，多見脂肪母細胞呈星形或短梭形，少見多核脂肪母細胞，瘤細胞核濃染類似墨水點樣(黏液型脂肪肉瘤細胞的典型特征)，小血管明顯擴張，密集排列，瘤細胞成分顯著減少，容易與淋巴管瘤混淆。

多形性脂肪肉瘤: 肉瘤細胞異型性明顯，可見瘤巨細胞或多核瘤細胞，胞漿豐富，可見脂肪空泡。去分化型脂肪肉瘤: 大多數瘤細胞核仁不明顯或可見小的核仁。肉瘤細胞胞漿少，細胞之間無細胞連接。見圖1。

2.2 p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白在脂肪肉瘤組織及肉瘤旁組織中的表達情況

p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白主要位于肉瘤細胞核。與肉瘤旁組織相比，脂肪肉瘤組織p53和E-cad蛋白陽性表達率較低, p16和cyclinD1蛋白陽性表達率較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖2。

A: 黏液型脂肪肉瘤(放大100倍); B: 黏液型脂肪肉瘤(放大400倍); C: 多形性脂肪肉瘤(放大100倍); D: 多形性脂肪肉瘤(放大400倍); E: 去分化型脂肪肉瘤(放大100倍); F: 去分化型脂肪肉瘤(放大400倍)。圖1 不同病理類型脂肪肉瘤組織的HE染色圖

2.3 p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白表達與脂肪肉瘤患者臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、肉瘤直徑和是否多發病灶患者的p53、p16、cyclinD1、E-cad蛋白陽性表達情況比較，差異均無統計學意義(P>0.05); 不同肉瘤部位、TNM分期、病理類型和有無局部復發、有無遠處轉移患者的p53、p16、cyclinD1、E-cad蛋白陽性表達情況比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、表3。

2.4 p53、p16、cyclinD1、E-cad蛋白表達與脂肪肉瘤患者預后的關系

本研究42例患者均獲得隨訪，隨訪率為100.00%(42/42), 截至2021年隨訪結束時，生存25例(59.52%), 死亡17例(40.48%, 均由脂肪肉瘤復發或惡化引起)。p53陽性表達患者、E-cad陽性表達患者中死亡人數分別少于p53陰性表達患者、E-cad陰性表達患者，差異均有統計學意義(P<0.05); p16陽性表達患者、cyclinD1 cyclinD1: 細胞周期蛋白D1; E-cad: E-鈣黏蛋白。

表1 p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白在脂肪肉瘤組織及肉瘤旁組織中的陽性表達情況[n(%)]

A: p53在肉瘤旁組織中陽性表達; B: p53在肉瘤組織中陰性表達; C: p16在肉瘤旁組織中陰性表達; D: p16在肉瘤組織中陽性表達; E: cyclinD1在肉瘤旁組織中陰性表達F: cyclinD1在肉瘤組織中陽性表達; G: E-cad在肉瘤旁組織中陽性表達; H: E-cad在肉瘤組織中陰性表達。圖2 p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白在脂肪肉瘤及肉瘤旁組織中的表達情況(PV-6000兩步法染色,放大200倍)

陽性表達患者中死亡人數分別多于p16陰性表達患者、cyclinD1陰性表達患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表2 p53、p16蛋白表達與脂肪肉瘤患者臨床病理特征的關系 例

表3 cyclinD1、E-cad蛋白表達與脂肪肉瘤患者臨床病理特征的關系 例

表4 不同p53、p16、cyclinD1和E-cad蛋白表達情況脂肪肉瘤患者的預后情況 例

3 討 論

脂肪肉瘤是在脂肪母細胞向脂肪細胞分化的各個階段均可發生的惡性腫瘤，其發病率居軟組織惡性腫瘤前列，臨床初始癥狀多不明顯，病理檢查結果顯示局部軟組織存在浸潤，其發病原因尚未闡明。

p53基因定位于人類染色體17p13, 是多種腫瘤的重要基因，其蛋白的異常表達現象出現在多種腫瘤中。野生型p53基因是一種抑癌基因，可抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞分化，使腫瘤細胞停留在G1期，通過誘導凋亡的方式消除異常細胞, p53失活對腫瘤形成起著重要作用, p53突變的細胞修復損傷DNA的效力降低，進而導致腫瘤細胞增殖能力增強[6]。本研究結果顯示，不同肉瘤部位、TNM分期、病理類型和有無局部復發、有無遠處轉移患者的p53蛋白陽性表達情況比較，差異有統計學意義(P<0.05), 其中肉瘤位于四肢、TNM分期為Ⅱ期、黏液型脂肪肉瘤、無復發和無遠處轉移患者的p53陽性表達率較高，且p53陽性表達患者生存時間較長，提示隨著脂肪肉瘤惡性程度的增加, p53蛋白表達減少。本研究結果佐證了p53是一種抑癌基因，其失活可促進腫瘤的發生與發展，這也是一些研究認為增加p53蛋白的穩定性、延長其半衰期，有助于延長惡性腫瘤患者生存期的可能原因。AVALLONE G等[6]研究顯示，犬脂肪肉瘤的p53表達與病理類型相關，在高分化型中呈陽性。ZUCO V等[7]收集8例脂肪肉瘤患者的肉瘤組織，發現均為p53基因突變，其中7例患者p53無表達。GONG L H等[8]收集2009—2017年北京積水潭醫院9例四肢去分化脂肪肉瘤患者的肉瘤組織，免疫組織化學結果顯示p53陽性者僅1例。但p53表達與脂肪肉瘤的關系仍存在爭議，例如孫萍萍等[9]分析114例腹膜后脂肪肉瘤患者的資料后發現, p53陽性百分比≥70%的患者生存中位數為21.1個月, <70%患者的生存中位數為56.3個月，提示p53表達可能對腫瘤細胞增殖存在雙重作用，但仍需進一步深入研究。

與p53基因相似,E-cad也是一種抑癌基因，其功能喪失參與了腫瘤的發生和發展。E-cad喪失功能后，組織內細胞黏附強度顯著降低，細胞活動性增加，腫瘤細胞可穿過基底膜并提升分化和侵襲能力，即細胞上皮間質轉化，而上皮間質轉化在腫瘤細胞的惡性表型中扮演重要角色。本研究結果顯示，不同肉瘤部位、TNM分期、病理類型和有無局部復發、有無遠處轉移患者的E-cad陽性表達情況比較，差異有統計學意義(P<0.05), 且E-cad陽性表達患者生存時間較長，提示隨著脂肪肉瘤惡性程度的增加, E-cad蛋白表達減少，與XIONG D等[10]研究結論相似。

p16的氨基末端存在與cyclinD1周期素盒編碼區同源的區域，故兩者異常表達在腫瘤的發生和發展過程可相互協同，使腫瘤細胞獲得顯著的生長優勢。正常組織不表達p16和cyclinD1, 但發生惡變后, p16和cyclinD1表達將顯著增高。劉族志等[11]報道口腔癌患者cyclinD1陽性率(40.00%)顯著高于對照組(14.29%), 而p16陽性患者3年生存率顯著低于p16陰性患者。李慶[12]報道皮膚鱗狀細胞癌的發生和進展與p16、cyclinD1等蛋白異常表達相關，且cyclinD1高表達與p53低表達具有相關性，兩者對骨肉瘤細胞的增殖與侵襲具有促進作用，聯合檢測可提高骨肉瘤的診斷效能[13], 與本研究結果相符。本研究尚存在不足之處，例如未深入分析p53、E-cad蛋白低表達是否與基因突變相關，且臨床對于p53基因表達與脂肪肉瘤患者病理參數及預后的關系仍爭議較大，未來需增加樣本量進一步深入探討。

綜上所述, p53、p16、cyclinD1、E-cad蛋白在脂肪肉瘤組織中均呈異常表達，且p53、E-cad、p16、cyclinD1蛋白表達情況與肉瘤部位、TNM分期、病理類型、局部復發和遠處轉移情況相關, p53、E-cad表達陰性患者和p16、cyclinD1表達陽性患者的預后不佳。