結(jié)直腸癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達(dá)和意義

金一鳴, 高 娜, 門學(xué)千, 向國卿

(遼寧省腫瘤醫(yī)院 內(nèi)鏡科, 遼寧 沈陽, 110042)

結(jié)直腸癌(CRC)是最普遍的惡性腫瘤之一，主要影響患者胃腸道，尤其是結(jié)腸、直腸和盲腸[1]。飲食習(xí)慣、炎癥反應(yīng)、DNA改變、遺傳多態(tài)性、基因-環(huán)境相互作用和微生物群組成的變化等被認(rèn)為是CRC發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素[2]。盡管診斷和治療技術(shù)不斷改進(jìn)，但許多CRC患者的臨床結(jié)果和預(yù)后仍然較差[3]。此外，可用于準(zhǔn)確預(yù)測早期CRC的可靠標(biāo)志物較少，使其診斷和治療具有一定難度[4]。微小RNA(miRNAs)是一類長度約為22個(gè)核苷酸的小型非編碼單鏈RNA, 在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。miRNA表達(dá)的改變與包括CRC在內(nèi)的各種癌癥之間有密切關(guān)系[5], 故miRNA可能對CRC患者具有重要的診斷和預(yù)后價(jià)值。研究[6]表明, miR-98-3p在肺癌、肝癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。miR-98在結(jié)腸癌患者的癌組織中低表達(dá)，與腫瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)[7]。DNA損傷結(jié)合蛋白1和CUL4相關(guān)因子(DCAF)家族可通過對其靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生長、分化、凋亡等生命活動(dòng)的調(diào)控。其中, DCAF7是DCAF家族蛋白的主要成員之一, DCAF7主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化[8], 但目前關(guān)于DCAF7在結(jié)直腸癌中表達(dá)的研究較少。因此，本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織中DCAF7、miR-98-3p的表達(dá)情況，探討二者在結(jié)直腸癌組織中的作用及與臨床病理特征的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2018年6月遼寧省腫瘤醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者70例為研究對象，收集其術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織。70例患者中男32例，女38例，年齡30～52歲，平均(37.50±1.40)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)影像學(xué)檢查、病理檢查確診為結(jié)直腸癌的患者; ② 首發(fā)腫瘤者; ③ 病理資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 嚴(yán)重心、肝、腎疾病，以及感染性疾病、其他惡性腫瘤患者; ② 術(shù)前接受過放療、化療及生物治療者。本研究所有患者及家屬均被告知，并獲得患者的知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測組織中miR-98-3p水平: 使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取組織中總RNA，使用分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，美國)對RNA進(jìn)行定量，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃ 30 min, 42 ℃ 42 min, 85 ℃ 5 min)。該cDNA作為RNA擴(kuò)增的模板，采用qRT-PCR法對miR-98-3p進(jìn)行擴(kuò)增(qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 共設(shè)40個(gè)循環(huán)), miR-98-3p以U6作為內(nèi)參，使用2-△△Ct方法對mRNA水平進(jìn)行定量分析。miR-98-3p及內(nèi)參引物序列見表1。miR-98-3p以患者的腫瘤組織相對表達(dá)水平中位數(shù)為臨界值，超過該范圍則判定為高表達(dá)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色觀察組織中DCAF7蛋白表達(dá): 所有手術(shù)切除標(biāo)本的石蠟包埋塊被切成4 μm厚的切片，并安裝在載玻片上。切片使用二甲苯脫蠟并在酒精中脫水。將組織切片與0.3%過氧化氫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，組織切片在微波爐中10 mmol/L檸檬酸緩沖液中煮沸10 min后，用10%正常兔血清緩沖液孵育20 min以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。檸檬酸修復(fù)抗原后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min, 加入一抗(DCAF7兔多克隆抗體)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗，加入二抗37 ℃孵育15 min, 進(jìn)行DAB染色以及蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片。根據(jù)切片的染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分: 0分為無陽性細(xì)胞; ≤25%的陽性細(xì)胞為1分; >25%～50%陽性細(xì)胞為2分, >50%陽性細(xì)胞為3分。染色強(qiáng)度: 無染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。綜合計(jì)分為以上2種評分相加, ≤3分判定為陰性, >3分判定為陽性。

1.2.3 Western blot法檢測DCAF7蛋白水平: 用RIPA裂解緩沖液(Pierce, 美國)裂解組織樣本，然后收集裂解液，用BCA蛋白檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司，中國)定量。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在室溫下在3%脫脂奶粉中封閉30 min, 隨后與一抗DCAF7(1∶1 000, Sigma-Aldrich, 美國)和GAPDH(1∶5 000, Proteintech, 中國)4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液(TBST)清洗10 min, 然后加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶10 000, 蘇州賽維斯生物科技有限公司，中國)室溫1 h。檢測使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑(美國密理博)進(jìn)行，將印跡的特定蛋白質(zhì)表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。Image J軟件用于分析條帶密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白的表達(dá)情況

結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白的陽性表達(dá)率為71.43%(50/70), 癌旁組織中陽性表達(dá)率為8.57%(6/70), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

A: 結(jié)直腸癌組織; B: 癌旁組織。

表2 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白陽性表達(dá)情況

2.2 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中DCAF7蛋白水平

結(jié)直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白的表達(dá)水平為(0.61±0.11), 高于癌旁組織的(0.19±0.02), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-98-3p水平比較

結(jié)直腸癌組織中miR-98-3p表達(dá)水平為(1.93±0.34), 低于癌旁組織的(3.67±0.71), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 結(jié)直腸癌患者癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達(dá)的相關(guān)性

分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者癌組織中DCAF7、miR-98-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.376,P<0.05)。見圖3。

2.5 DCAF7蛋白和miR-98-3p表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡以及腫瘤直徑、腫瘤位置、浸潤程度無關(guān)(P>0.05), 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和分化程度有關(guān)(P<0.05); miR-98-3p表達(dá)與患者的性別、年齡、浸潤程度以及腫瘤位置無關(guān)(P>0.05), 與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑和分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.6 結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白和miR-98-3p

水平對結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量評估結(jié)直腸癌的曲線下面積(AUC)分別為0.864(95%CI: 0.796～0.916)、0.835(95%CI: 0.763～0.892), 對應(yīng)的敏感度分別為82.86%、90.00%, 特異度分別為78.57%、68.57%。二者聯(lián)合評估結(jié)直腸癌的AUC為0.952(95%CI: 0.902～0.981), 敏感度為97.14%, 特異度為77.14%。見圖4。

表3 結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白、miR-98-3p的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

CRC是全球第三大最常見的癌癥類型[9]。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與生活方式、遺傳因素、結(jié)直腸腺瘤密切相關(guān)。該病的病因與個(gè)體基因突變有關(guān)，包括不同類型的染色體突變和DNA錯(cuò)配修復(fù)[10]。近年來，新的治療方法和診斷技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，顯著降低了CRC的病死率。然而, CRC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。

miRNA在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[11]。研究[12-14]表明, CRC中miR-143和miR-145表達(dá)顯著下調(diào)，提示miRNA可能成為CRC治療中潛在的基因治療靶點(diǎn)。研究[15]表明, miR-98在多種腫瘤中呈低表達(dá)，與口腔鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肺癌等的轉(zhuǎn)移有關(guān)，例如miR-98通過靶向一型胰島素樣生長因子受體(IGF1R)表達(dá)來抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移。此外, miR-98通過下調(diào)整合素B3(ITGB3)抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移和侵襲。miR-98-3p是miR-98家族重要成員，在本研究中，結(jié)直腸癌組織中miR-98-3p水平低于癌旁組織，結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-98-3p表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤位置和浸潤程度無關(guān)，與TNM分期、分化程度、腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。上述結(jié)果提示miR-98-3p與結(jié)直腸癌的惡性程度相關(guān)，并參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

DCAF蛋白家族是機(jī)體維持正常生長發(fā)育的重要蛋白質(zhì)家族，參與細(xì)胞增殖分化、凋亡等一系列調(diào)控，該家族已累計(jì)發(fā)現(xiàn)60種蛋白，其蛋白過表達(dá)或缺失與臨床許多腫瘤、發(fā)育障礙等的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，為腫瘤的臨床治療提供更多方向[7]。磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(DYRK1A)是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化之間平衡的一個(gè)重要激酶。研究[16]發(fā)現(xiàn), DCAF7與DYRK1A互相作用，參與維持其穩(wěn)定性。但目前關(guān)于DCAF7在結(jié)腸癌中的研究較少。本研究中，結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白水平顯著高于癌旁組織，結(jié)直腸癌組織中DCAF7蛋白陽性表達(dá)率為71.43%, 癌旁組織中DCAF7陽性表達(dá)率為8.57%; 結(jié)直腸癌患者癌組織中DCAF7蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑和浸潤程度無相關(guān)性，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有相關(guān)性，提示DCAF7蛋白也與結(jié)直腸癌的惡性程度相關(guān)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中DCAF7與miR-98-3p表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，推測二者之間存在某種負(fù)調(diào)控關(guān)系，共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線顯示，外周血DCAF7蛋白和miR-98-3p含量評估結(jié)直腸癌的AUC分別為0.864、0.835, 對應(yīng)的敏感度分別為82.86%、90.00%, 特異度分別為78.57%、68.57%。二者聯(lián)合評估結(jié)直腸癌的AUC為0.952, 敏感度為97.14%, 特異度為77.14%。這表明DCAF7與miR-98-3p有望成為結(jié)直腸癌診斷的潛在指標(biāo)。

綜上所述, DCAF7在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá), miR-98-3p呈低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，可作為判斷結(jié)直腸癌患者病情發(fā)展的潛在生物指標(biāo)，二者的表達(dá)可對患者臨床病理特征進(jìn)行一定的判斷分析，但二者在結(jié)直腸癌患者中的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。