重型顱腦損傷患者血漿外泌體微小RNA-202-5p表達水平及其對預后的預測價值

張穎潔, 王詩波, 諸 靖, 王 靜, 虞大為

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院 急診科, 江蘇 無錫, 241000)

重型顱腦損傷是一種非常嚴重的顱腦創傷，其特點是致殘率、病死率高[1]。格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分和鹿特丹計算機斷層掃描(CT)常被用作預測預后的指標[2-3]。但研究發現，這些指標準確率差，容易受到多種因素的干擾，因此尋找更佳靈敏的指標用于早期評估創傷嚴重程度和預測重型顱腦損傷(sTBI)的預后成為研究熱點。sTBI患者神經功能缺損主要涉及到神經元細胞凋亡、炎癥反應及自噬等復雜機制。微小RNA(miRNA) 參與多種生物學行為，研究[4-5]發現, miRNA與腦損傷的發生和進展密切有關。miR-202-5p具有抗腫瘤、調控細胞凋亡和自噬及保護腦神經元細胞缺血再灌注損傷等功能[6-8]。本研究分析了sTBI患者血漿外泌體miR-202-5p的水平，并探討其對sTBI預后的預測能力，以期為sTBI的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年12月收治的sTBI患者78例為研究對象，其中男43例，女35例; 年齡18～53歲，平均(42.4±5.3)歲。納入標準: ① 經臨床、影像學檢查符合sTBI診斷標準[9]者; ② 外傷病史明確者; ③ 入院GCS評分為3～8分者; ④ 年齡≥18周歲者; ⑤ 臨床資料無缺失者。排除標準: ① 既往有腦血管意外疾病、顱腦外傷者; ② 嚴重的心、肝、腎功能不全者; ③ 合并惡性腫瘤者; ④ 受傷到住院時間長于12 h者; ④ 有先天性疾病導致神經功能障礙者。另外選取同期體檢中心健康人群50例為對照組，其中男29例，女21例; 年齡20～52歲，平均(41.7±4.8)歲。2組研究對象一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究患者家屬簽訂書面知情同意書，并獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集: 入院后收集患者各項指標，包括年齡、性別、是否有吸煙或飲酒史、高血壓、糖尿病、高脂血癥等，記錄從受傷到入院的時間，測量入院時血壓，記錄入院時GCS評分[10]和鹿特丹CT評分[11], 計算入院時急性生理學和慢性健康狀況評價Ⅱ(APACHE Ⅱ)評分。

1.2.2 預后判斷: 根據入院后3個月時格拉斯哥預后量表(GOS)評分將患者分為預后良好和預后不良。GOS評分≤3分定義為預后不良, >3分定義為預后良好。GOS評分中, 1分為死亡, 5分為神經功能基本正常[10]。

1.2.3 血清外泌體的分離及鑒定: 患者住院當日，健康人群于體檢當日抽取肘靜脈血5 mL, 150×g常溫下離心15 min, 保留上清血漿。使用exoEasy Maxi kit試劑盒(Qiagen公司)提取外泌體，取10 μL滴于銅網上，滴加10 μL濃度為2%的醋酸雙氧鈾于銅網上靜置1 min, 室溫下放置10 min, 在透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態。采用Nano Sight納米粒度儀檢測外泌體顆粒濃度。

1.2.4 CD63蛋白量表達水平檢測: 采用蛋白質印跡法檢測CD63蛋白量表達水平。向提取的外泌體中加入1 mL RIPA液及PMFP液，冰上孵育30 min, 4 ℃ 14.0×g離心5 min, 保留上清液, 100 ℃下煮沸10 min, 檢測蛋白濃度,15孔梳子中各孔加入20 μg蛋白，電泳1 h, 轉膜45 min, 配好的封閉液封閉1 h, 兔抗人單克隆CD63(1∶1 000, Affinity Biosciences, 美國)4 ℃過夜，洗滌緩沖液(TBST)洗滌3 次，相應的二抗室溫1 h, TBST洗滌3 次。然后上機曝光，采用Image J分析灰度值。

1.2.5 外泌體miR-202-5p表達水平檢測: 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測外泌體miR-202-5p表達水平。取外泌體200 μL, 加入1 mL Trizol, 利用一步法提取總RNA, 檢測其濃度，合成cDNA, 按照熒光定量試劑盒說明進行聚合酶鏈反應，反應條件: 95℃預變性10 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min, 共40個循環，相對表達量用2-△△Ct法計算。引物序列如下, miR-202-5p正向序列: 5′-TTCCTATGCATATACTTC-3′; 反向序列: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′ ,U6正向序列: 5′-ACACTCCAGCTGGGGTGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′; 反向序列: 5′-AGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 血清外泌體的形態特征

納米顆粒跟蹤(NTA)分析顯示，外泌體直徑為80～300 nm, 分散均勻，峰值為130 nm左右。透射電子顯微鏡顯示，外泌體呈圓形或橢圓形，直徑50～120 nm。蛋白質印跡法結果顯示，外泌體CD63蛋白表達水平為 (3.5±0.4), 高于血細胞的(0.2±0.1), 差異有統計學意義(t=13.304,P<0.01)。見圖1。

2.2 sTBI患者與健康人群血漿外泌體miR-202-5p表達水平比較

sTBI患者血漿外泌體miR-202-5p的表達水平為(0.8±0.1), 低于正常群體的(3.7±0.2), 差異有統計學意義(t=12.235,P<0.01)。

2.3 預后良好和預后不良患者一般資料比較

預后不良患者(n=27) GCS評分、miR-202-5p水平及鹿特丹CT評分低于預后良好(n=51)患者, APACHE Ⅱ評分高于預后良好患者，差異均有統計學意義(P<0.05), 而性別、年齡、吸煙、飲酒、基礎性疾病、外傷至入院時間及平均動脈壓比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 sTBI患者預后的多因素Logistic回歸分析

將GCS評分、miR-202-5p水平、APACHE Ⅱ評分及鹿特丹CT評分定義為自變量，患者預后定義為應變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示, GCS評分、miR-202-5p水平、APACHE Ⅱ評分及鹿特丹CT評分是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05), 見表2。

2.5 血漿外泌體miR-202-5p水平與鹿特丹CT評分、GCS評分及APACHE Ⅱ評分的相關性

血漿外泌體miR-202-5p水平與鹿特丹CT評分和GCS評分呈正相關(r=0.703、0.711,P<0.01), 與APACHE Ⅱ評分呈負相關(r=-0.693,P<0.01)。

2.6 血漿外泌體miR-202-5p水平對患者預后的預測價值分析

miR-202-5p預測患者預后的ROC曲線下面積(AUC)、靈敏度及特異度分別為0.744、69.0%及69.0%, 截斷值為0.54。APACHE Ⅱ評分的AUC、靈敏度及特異度分別為0.667、74.0%及60.6%。鹿特丹CT評分的AUC、靈敏度及特異度分別為0.611、59.0%及62.0%。GCS評分的AUC、靈敏度及特異度分別為0.672、80.0%及53.5%。見圖2。

3 討 論

sTBI是最嚴重的顱腦外傷之一，病情危重，發展迅速，預后不佳，因此如何在早期預判疾病進展和評估患者預后，已成為目前國內外研究的熱點。miRNA參與多種細胞生物學過程，與多種疾病的發生和預后有關[12]。外泌體是從細胞分泌出來的直徑為40～100 nm的膜泡，其內部包含多種信號分子，如蛋白質、miRNAs、神經節苷脂等，且外泌體容易獲取，其內部物質穩定性高，已成為生物學標記物理想的載體[13]。近年來，外泌體來源的miRNAs在顱腦外傷中的應用研究越來越多，有文獻[14-16]報道，顱腦損傷患者外周血多種miRNAs呈差異表達，并與疾病進展、預后有關，提示外泌體來源的miRNA可用于評估顱腦外傷患者的預后。

表1 預后良好和預后不良患者一般資料比較

表2 sTBI患者預后的多因素Logistic回歸分析

動物實驗[17]表明，心肌缺血再灌注損傷的大鼠低表達的miR-202-5p和過表達的miR-202-5p可有效抑制心肌梗死和心肌酶表達。覃燕生[18]研究發現，動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者血漿外泌體miR-202-5p水平升高，且與疾病嚴重程度和預后有關。另外，體外實驗研究[8]發現, miR-202-5p過表達促進了缺氧/復氧處理N2a細胞的增殖能力，抑制了細胞凋亡，同時顯著減少了腦缺血再灌注損傷大鼠模型的梗死面積，但外泌體來源的miR-202-5p與顱腦外傷的關系尚不清楚。本研究結果顯示, sTBI患者血漿外泌體miR-202-5p表達水平低于與健康人群，并且預后不良患者miR-202-5p表達水平低于預后良好患者，表明外泌體miR-202-5p的減少與sTBI病情的加重有關，但具體機制有待進一步研究證實。

GCS評分是目前臨床常用的評估顱腦外傷患者意識障礙的量表，評分越低，預后越差[19-20]。鹿特丹CT評分是用于評估腦外傷患者腦組織損傷程度的一套影像學評價系統，與患者預后呈負相關[21-22]。APACHE Ⅱ評分是危重病常用評估指標，分數越高，病情越嚴重。研究[23-24]證實, GCS評分、鹿特丹CT評分及APACHE Ⅱ評分是評估腦外傷患者預后的可靠指標。本研究結果同樣證實了上述3個指標也是影響sTBI患者預后的危險因子, miR-202-5p是sTBI患者預后不良的獨立預測因素。明確血漿外泌體miR-202-5p與疾病發生、預后有關后，本研究進一步利用ROC曲線分析了miR-202-5p對sTBI患者預后的預測價值，結果發現, miR-202-5p預測患者死亡的AUC為0.744, 具有一定的預測價值。另外, miR-202-5p預測AUC優于GCS評分、鹿特丹CT評分及APACHE Ⅱ評分。因此，血漿外泌體miR-202-5p水平可用于評估sTBI患者預后。

綜上所述, sTBI患者血漿外泌體miR-202-5p低表達是預后的獨立危險因素，但本研究結果仍需要進一步驗證。