2例新型冠狀病毒肺炎病例的流行病學及基因特征分析

王 寅, 黃 瑤, 張 軍, 李鑫娜, 周 樂, 朱維維, 楊慶貴, 徐 勤, 孔桂美

(1. 江蘇省揚州市疾病預防控制中心, 江蘇 揚州, 225002; 2. 江蘇國際旅行衛生保健中心, 江蘇 南京, 210000; 3. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225009)

新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的一種急性呼吸系統新發傳染病，主要臨床表現為發熱、咳嗽以及一些不太典型的肺外表現。新冠肺炎的大流行促使SARS-CoV-2不斷發生進化和變異，對疫情防控造成了巨大的負面影響[1]。奧密克戎變異株于2021年11月在南非被首次發現[2], 此后該變異株迅速傳播至全球數百個國家和地區，對人類的身心健康產生了嚴重影響[3-4]。江蘇省揚州市于2022年1月首次報告新冠肺炎奧密克戎變異株感染病例，此后于當月又發現1例感染病例。本研究采用第3代納米孔測序技術對2例境外輸入新冠肺炎奧密克戎變異株感染患者進行全基因組基因測序，并進行流行病學溯源分析和實驗室檢測結果分析，旨在為SARS-CoV-2奧密克戎變異株感染的疫情防控及時提供數據支持和決策依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將江蘇省揚州市2022年1月5日和1月23日在中國傳染病報告管理信息系統中報告的2例境外輸入新冠肺炎確診病例作為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 調查方法: 按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》的要求對研究對象開展面對面流行病學調查，排查追蹤其密切接觸者，并對其集中隔離醫學場所進行風險評估。

1.2.2 資料收集: 收集2例患者的流行病學調查資料及其在揚州市第三人民醫院就診的資料。

1.2.3 病例判定: 按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第八版)》的要求，結合揚州市新冠肺炎醫療救治組專家會診結果判定病例。

1.2.4 實驗室核酸及抗體檢測: 按照《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》中《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》的要求，采用碩世核酸提取儀及核酸提取試劑盒提取病毒核酸，并采用ABI7500熒光定量PCR儀、江蘇碩世生物科技有限公司和北京卓誠生物科技有限公司SARS-CoV-2檢測試劑盒進行核酸檢測，實驗過程及結果判讀嚴格按照試劑盒說明書要求進行。血清中SARS-CoV-2免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)抗體水平使用英諾特新型冠狀病毒IgM/IgG抗體膠體金檢測試劑和邁克生物公司全自動化學發光免疫分析儀i3000及其配套試劑進行檢測。

1.2.5 測序文庫構建和全基因組測序[5]: 參照北京微未來ULSEN超靈敏度新型冠狀病毒全基因組捕獲試劑盒說明書的要求對病毒全基因組進行擴增，采用Qubit3.0熒光定量儀對擴增產物進行定量，連接測序試劑盒(SQK-LSK109, Oxford Nanopore)用于制備測序文庫。使用Oxford Nanopore MK1C納米孔測序系統和Flow Cell芯片(Flow Cell Primming Kit，貨號EXP-FLP002)以第3代納米孔全基因組測序技術進行SARS-CoV-2全基因組測序。

1.2.6 序列拼接與分析: 使用杭州柏熠科技有限公司的SARS-CoV-2全基因組分析系統對第3代測序數據進行組裝拼接，獲得全基因組序列，并在線(https: //clades. nextstrain. org/)進行型別及變異位點分析。采用DNAstar Lasergene V7.0軟件進行全基因組序列比對和同源性分析，參比序列來源于GISAID數據庫不同型別變異株，使用PhyloSuiteV 1.2.2軟件繪制系統發育樹，進行5 000次bootstrap抽樣，構建最大似然法系統發育樹。

2 結 果

2.1 流行病學調查結果

2.1.1 基本信息: 2例新冠肺炎確診病例的流行病學調查基本信息見表1。

表1 2例新冠肺炎確診病例的流行病學調查基本信息

2.1.2 密切接觸者判定和管理: 根據《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》密切接觸者的判定原則，初步判定2個班次轉運車(昆山至揚州酒店隔離點)的19名同車人員為密切接觸者，均采取14 d集中隔離醫學觀察及7 d居家健康監測。其余人員均接受閉環管理或采取有效防護措施，故未納入密切接觸者人群，僅作為一般接觸者開展健康監測和核酸檢測。

2.2 實驗室核酸檢測結果

病例1 于2021年12月31日入境時雙采口咽拭子和鼻咽拭子, SARS-CoV-2核酸檢測結果為陰性, 2022年1月4日進行鼻咽拭子單采, SARS-CoV-2核酸檢測結果為陽性。病例2于2022年1月18日入境時雙采口咽拭子和鼻咽拭子, SARS-CoV-2核酸檢測結果為陰性, 2022年1月22日進行鼻咽拭子單采, SARS-CoV-2核酸檢測結果為陽性。2例患者鼻咽拭子單采的SARS-CoV-2核酸檢測結果見表2。

2.3 血清抗體檢測結果

2例患者SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體的膠體金法檢測結果均為陰性; 化學發光法抗體檢測結果顯示，病例1的IgG抗體為陽性[吸光度值與臨界值比值(S/CO)>1為陽性，反之為陰性], IgM抗體為陰性，病例2的IgG、IgM抗體均為陰性。見表3。

表2 2例新冠肺炎確診病例SARS-CoV-2核酸檢測結果

表3 2例新冠肺炎確診病例血清SARS-CoV-2抗體檢測結果

2.4 基因測序結果

2.4.1 基因組測序基本情況: 對病例1與病例2的標本進行第3代納米孔基因組測序，基因組平均測序深度分別為3 701.33×與4 710.93×, 基因長度分別為29 873 bp與29 850 bp, 全基因組基因測序覆蓋度分別為99.85%與99.83%, 與標準參考序列MN. 908 947.3比對，基因序列一致性均為99.62%, 氨基酸序列一致性分別為99.60%與99.31%, 2例標本基因序列一致性為99.83%, 氨基酸序列一致性為99.52%。

2.4.2 基因組變異位點結果分析: 將拼接后的基因序列上傳至https: //clades. nextstrain. org/進行型別及變異位點分析，參照Pangolin分型法與Nextstrain分型法，病例1屬于BA. 1.1與21K, 病例2 屬于BA. 2.3與21L, 與標準參考序列MN. 908 947.3相比, 2組序列在S蛋白分別出現31、28個氨基酸位點突變，共享39個核苷酸變異位點，產生32個氨基酸突變位點。病例1的核苷酸突變位點、氨基酸突變位點分別為57、47個，病例2的核苷酸突變位點、氨基酸突變位點分別為68、52個，具體突變位點見表4。

2.4.3 系統進化樹分析: 將測得的全基因組序列與從GISAID數據庫下載的不同型別變異株參考序列共62條進行比對，構建系統發育樹，發現不同型別毒株歸屬于不同進化分支。2例患者感染的SARS-CoV-2毒株均屬于奧密克戎變異株，但屬于不同亞變體，病例1屬于BA. 1.1分支，與hCoV-19_USA_FLCDC-STMN2MXMA3HU_2021同源性最高，達到99.95%，病例2屬于BA2.2.3分支，與hCoV-19_Finland_THL-202205846_2022、hCoV-19_Japan_PG-177427_2022、hCoV-19_England_NEWC-3B0D0F0_2022同源性最高，達到100.00%，見圖1。

3 討 論

截至2022年2月22日，江蘇省共報告28例境外輸入奧密克戎變異株所致新冠肺炎病例，其中19例為BA.1型(占67.86%)，9例為BA.2型(占32.14%)。揚州市報告的第2例境外輸入新冠肺炎奧密克戎變異株感染病例屬于BA.2型分支(全省首例)，而全省奧密克戎變異株分支型別的變化規律是由以BA.1型為主逐漸向BA.1型與BA.2型混合轉變。

表4 病例1與病例2的基因組核苷酸突變位點、氨基酸突變位點

SARS-CoV-2奧密克戎變異株BA.1.1及BA.2.3高頻出現于歐美國家，根據流行病學調查情況和第3代基因測序結果，本研究推斷病例1在芬蘭被感染的可能性較大，病例2在加納或荷蘭被感染的可能性較大(在此期間，上海市集中隔離點與揚州市集中隔離點14 d內均未有確診病例，而其密切接觸者經14 d集中隔離觀察后亦未確診，故判定其在隔離點及轉運過程中被感染的可能性幾乎不存在)。2例患者臨床癥狀均較輕，僅有輕微的呼吸道癥狀，與目前SARS-CoV-2奧密克戎變異株感染病例的臨床癥狀一致，即以輕微癥狀為主，重癥很少，且無其他變異株感染引發的味覺或嗅覺喪失等新冠肺炎典型癥狀[6]。2例病例均采取嚴格的閉環管理措施，且所有轉運人員佩戴N95口罩，后續未有相關病例檢出。相關研究[4]證明, SARS-CoV-2奧密克戎變異株致病性不強、傳染性極強，但嚴格閉環管理和規范佩戴口罩可有效預防新冠肺炎感染，且現行防護措施對奧密克戎變異株同樣有效。

實驗室核酸檢測結果顯示，2例境外輸入奧密克戎變異株所致新冠肺炎病例的核酸檢測Ct值較低，提示感染病毒載量較高[7]。本研究采用膠體金法和化學發光法進行抗體檢測，其中膠體金法無需任何儀器設備，可在不同條件下直接檢測并觀察結果，但易受多種因素干擾且存在一定風險，而化學發光法則具有高通量、自動化、低風險、高靈敏度等優點[8]。膠體金法檢測結果顯示, 2例病例SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體均為陰性; 化學發光法檢測結果顯示，病例1的IgM抗體為陰性, IgG抗體為陽性，病例2的IgM、IgG抗體均為陰性。病例1的IgG抗體的膠體金法檢測結果與化學發光法檢測結果不一致，結合此前流行病學調查結果(病例1感染前接種過輝瑞新冠肺炎疫苗2針次)，推測其IgG抗體因免疫應答反應而呈陽性，符合化學發光法檢測結果，其膠體金法檢測結果為陰性可能是因為膠體金法相較于化學發光法靈敏度較低。ZHOU J A等[9]也證實，相較于膠體金法，化學發光法應用于SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體檢測具有更可靠的實用性和靈敏度。研究[10]證實SARS-CoV-2變異株即使在免疫人群中也具有較高的傳播率，本研究病例1亦未因接種過新冠肺炎疫苗而免于感染。相關研究[7]稱SARS-CoV-2 IgM抗體在患者感染1周內陽性率較低，初始感染期Ct值較低，本研究通過實驗室檢測結果和入境時核酸檢測陰性結果推測2例病例均為新發感染。

奧密克戎變異株是目前已知的SARS-CoV-2變異株中S蛋白變化位點最多的，包含其他4種關切變異株(VOC)S蛋白上出現的所有重要的氨基酸變異位點。本研究第3代基因測序結果也證實了這一點, 2例病例感染的奧密克戎變異株與標準參考株相比，在S蛋白上分別存在32、28個氨基酸位點改變，在受體結合區域(RBD)共享12個氨基酸突變位點，為G339D[11]、S373P[12]、S375F[13]、K417N[14]、N440K[15]、S477N[16]、T478K[12]、E484A[13]、Q493R[13]、Q498R[15]、N501Y[11]和Y505H[16], 這些位點已被證實與奧密克戎變異株產生免疫逃避機制相關。病例2序列BA. 2.3與病例1序列BA. 1.1相比, RBD多出了T376A、D405N和R408S這3個突變位點，缺少了G446S[16]、G496S[12]突變位點, RBD上的這些位點差異可能導致其對多種治療性抗體的抗性不同，這些突變對疾病傳播、發病機制和疫苗效力的影響正在深入研究中[17-18]。

進化樹分析顯示，SARS-CoV-2的突變是一個連續過程，會導致多種變異株的出現，而新變種奧密克戎乃至其他變種的不斷出現導致了新冠肺炎疫情的持續。目前，關于奧密克戎變異株的研究仍在繼續，以往關于阿爾法變異株和德爾塔變異株的研究經驗提示，只有長時間進行嚴密監測，才能得到更多關于該新變種的信息，例如其傳播特點、疫苗效力和嚴重性等。本研究認為，采取科學的防疫措施，加快、加強境外輸入風險管控，堅持采取有效的個人防護措施切斷傳播途徑，保護易感人群，根據變異株基因進化趨勢隨時調整疫苗接種策略，仍將是遏制新冠肺炎新毒株傳播和防止出現新冠肺炎重癥與死亡病例的關鍵方法。

目前，新冠肺炎感染患者臨床樣本的基因組測序多采用第2代測序技術，本研究采用的第3代納米孔測序技術屬于單分子測序技術，與第2代測序技術相比，其具有讀長長、速度快、測序數據實時監控等優點[19]。研究[20-22]表明，納米孔測序平臺應用于新冠肺炎疫情的基因測序中表現良好，尤其適用于病毒載量低的標本。本研究使用第3代測序平臺納米孔測序技術對SARS-CoV-2標本成功進行測序, 1 d內完成了PCR靶向擴增、建庫、測序及數據分析等步驟，成功獲得2例患者奧密克戎變異株的全基因組序列并進行溯源分析，大大縮短了測序時間。由此提示，第3代納米孔測序技術可有效應用于SARS-CoV-2的溯源分析，上機半小時即可鎖定病毒的型別及來源，在應對突發疫情時可極大節省時間，盡快為疫情防控指明方向，在地市級疾控機構精準化防控策略的制訂與實施中具有較高的應用價值。