檢測肺炎支原體新方法的建立及應用

周麗娟, 吳艷凌, 周 林, 刁葉秋, 王正芳, 王廣洲

(揚州大學臨床醫學院/江蘇省蘇北人民醫院 醫學檢驗科, 江蘇 揚州, 225001)

肺炎支原體(Mp)是一種常見的病原微生物，主要通過呼吸道傳播，其不僅可引起多種呼吸道疾病，還可導致肺外其他系統的多種并發癥[1]。呼吸道病原體引起的感染癥狀比較相似，很難靠臨床癥狀及常規檢測方法進行明確的早期診斷。因此，快速、高靈敏、高特異性的檢測方法對診斷、鑒別呼吸道病原體感染至關重要。環介導等溫擴增(LAMP)技術實現了恒溫條件下的連續快速擴增核酸片段[2], 但該技術也存在缺陷，其沒有聚合酶鏈式反應(PCR)熱循環以避免引物之間的結合，因此恒定溫度下的反應很難避免部分非特異性擴增[3]。

成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)技術是一種以序列特異性方式修飾內部DNA/RNA編輯基因的技術，具有簡單、廉價和高效等優勢。為解決LAMP非特異擴增的缺點，研究人員已經開始使用CRISPR結合LAMP來進行核酸的體外檢測[4-5], 其已成功應用于農業、治療和感染因子、食品工業和生物能源等眾多領域[6]。本研究擬建立CRISPR-LAMP檢測Mp的新方法，以實現Mp快速、精準檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取2021年1月—2021年12月入住蘇北人民醫院兒科的患兒50例，其中30例為Mp感染, 20例為非Mp感染。采集患兒口咽拭子, -70 ℃儲存，集中進行檢測。

1.2 材料

Loopamp?DNA擴增試劑盒和LAMP法熒光檢測試劑盒購自日本榮研公司, EnGen?Lba Cas12a (Cpf1)購自New England Biolabs公司, MpDNA質控品購自廣州健侖生物科技有限公司，甲流病毒(FluA)標準物質及乙流病毒(FluB)標準物質購自上海計量院，肺炎克雷伯氏菌(Kp)、肺炎鏈球菌(Sp)臨床菌株來源于本院醫學檢驗科微生物室。

1.3 引物設計

采用Primer Explorer Version 5 軟件設計LAMP引物，采用Deskgen軟件設計CRISPR/Cas12a crRNA, 委托上海生工生物工程有限公司合成。引物及crRNA序列見表1。

1.4 CRISPR-LAMP單管一步法檢測

LAMP引物配制，使用去離子雙蒸水溶解引物至如下工作濃度: F3(5 μmol/L)、B3(5 μmol/L)、FIP(40 μmol/L)、BIP(40 μmol/L)、LB(40 μmol/L)。

LAMP反應液12.5 μL∶2×反應緩沖液(RM), 6.0 μL; F3、B3、FIP、BIP、LB各0.5 μL; Bst DNA聚合酶 0.5 μL; 去離子水2.5 μL、DNA 1.0 μL。

Crispr 12a反應液: 2.0 μL 10×NEB buffer, 7.5 μL H2O, 1.0 μL Cas12a, 1.0 μL crRNA, 1.0 μL ssDNA report。

CRISPR-LAMP單管一步法反應體系為25.0 μL, 檢測步驟及流程見圖1。將12.5 μL Crispr/Cas12a 試劑加在試管蓋上, 12.5 μL LAMP反應試劑加在管底，并在LAMP試劑上加1層礦物油; 蓋上管蓋, 65 ℃反應40 min; 將試管上下顛倒混勻, Cas12a試劑與LAMP反應產物充分混勻后, 37 ℃反應15 min; 470 nm藍光燈(藍光透射儀OSE-470-12)照射反應試管，陽性結果呈現綠色熒光。

表1 Mp LAMP 引物及crRNA序列

1.5 Mp PCR方法

Mp檢測的引物序列為F: 5′-GGCCGTAACTATAACGGTCC-3′; R: 5′- AGACCCCGTGAAGCTTTACT-3。擴增條件: 95 ℃預變性3 min; 30循環，條件為95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 72 ℃ 10 min。使用儀器為天隆科技Genesy 96T基因擴增熱循環儀，購自西安天隆科技有限公司。

1.6 靈敏度分析

Mp基因組DNA稀釋至10.0 ng/μL, 應用NanoDrop 1000微量紫外可見分光光度計(美國Thermo Scientific), 配置1×106fg/μL、1×104fg/μL、1×102fg/μL、1×10 fg/μL和1 fg/μL的Mp DNA標準品。ddH2O為陰性對照。分別采用CRISPER-LAMP單管一步法和PCR法檢測上述標準品，以評估CRISPER-LAMP單管一步法的靈敏度。

1.7 特異性分析

采用AllPrep?DNA Mini Kit試劑盒提Kp、Sp基因組DNA, 每份DNA樣本稀釋至10 ng/μL與MpDNA質控品、FluA標準物質及FluB標準物質進行CRISPER-LAMP單管一步法檢測。

1.8 統計學方法

PCR法結果與CRISPER-LAMP單管一步法結果一致性采用Cohen′s Kappa 檢驗。

2 結 果

2.1 CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp靈敏度

以稀釋的Mp DNA標準品為檢測模板進行反應, CRISPR-LAMP單管一步法結果見圖2A、2B。A為熒光檢測儀(Biotek Synergy)檢測反應產物熒光值, B為可視化檢測結果。應用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR法擴增Mp DNA系列濃度標準品的產物，結果見圖2C。結果顯示, CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp檢出限為10 fg/μL, PCR法檢測Mp檢出限為100 fg/μL。

2.2 CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp的特異性分析

CRISPR-LAMP單管一步法檢測FluA, FluB、Kp、Sp反應均為陰性; Mp為陽性，結果見圖3A、3B。結果顯示, CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp具有高特異性，與咽拭子中可能存在的病原體不存在交叉污染檢測。

2.3 CRISPR-LAMP法與PCR法檢測臨床樣本的一致性

CRISPR-LAMP單管一步法檢測50例臨床標本(30例Mp感染樣本; 20例臨床非Mp感染標本)，其中30例陽性, 20例陰性。CRISPR-LAMP單管一步法與PCR法一致性較好(Kappa值為1), 見表2。

A: CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp熒光檢測結果; B: CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp可視化檢測結果,陽性結果呈現綠色熒光; C: PCR檢測Mp DNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果; M: DNA梯狀標志; 1～5分別為1×106 fg/μL、1×104 fg/μL、1×102 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL Mp DNA, N為陰性對照。圖2 CRISPR-LAMP單管一步法及PCR法檢測Mp靈敏度分析

3 討 論

實驗室病原學檢測是Mp感染診斷的關鍵，檢測Mp的傳統方法為分離培養和血清學試驗。但培養法因周期較長、靈敏度低在臨床應用中受到極大限制; 血清學抗體檢測也不能實現Mp早期檢測，故上述方法限制了其在臨床實驗室的廣泛開展[7]。PCR技術在實驗室診斷中起到了關鍵的作用，目前已成為Mp首推的重要的檢測手段之一，但用于臨床實驗室的PCR技術都需依賴特定場所、設備、儀器及經培訓上崗的工作人員，操作復雜、費時、技術要求高，不適合Mp檢測的常規開展[8]。血清學、培養法、分子檢測在臨床實踐中各有優缺點，因此亟需研發、轉化可靈敏、準確鑒定Mp的新技術方法。

表2 CRISPR-LAMP法與PCR法檢測臨床標本一致性(n=50)

LAMP技術已應用于塞卡病毒、新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2)等多種病原體的檢測[9-11]。該技術克服了傳統PCR反應需通過反復熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，并避免了反復降溫的耗時過程，可以在15～60 min擴增出109～1010倍靶序列拷貝，具有高靈敏度和擴增效率。CRISPR-Cas系統是原核生物中的一種適應性免疫系統，其在細菌宿主染色體中以病毒DNA的形式存儲記憶，以防止噬菌體感染[12]。在CRISPR-Cas效應子家族中, Cas12a系統能在識別靶點后誘導任意單鏈DNA(ssDNA)的分裂，在分裂位點釋放熒光信號[13]。

本研究利用CRISPR可進一步提高LAMP反應的特異性這一優勢，建立了CRISPR-LAMP單管一步法檢測Mp。因CRISPR-Cas12a系統的高特異性，當特殊設計的crRNA與靶標Mp病原體DNA配對后，與Cas12a蛋白形成復合物，激活該蛋白的切割活性，進而引起熒光信號的釋放，從而應用藍光透射儀實現了熒光可視化的檢測。該法可檢測到10 fg/μL的Mp DNA, 檢測靈敏度高于傳統的PCR技術(100 fg/μL)一個數量級，與TAO D G等[14]研究結論相一致。

在核酸檢測實驗中的主要問題是氣溶膠污染導致的假陽性[15]。本方法中雖然LAMP擴增溫度為65 ℃, CRISPR體系的反應溫度為37 ℃, 但本研究組利用礦物油把2個反應系統分隔放置在一個試管的不同位置。LAMP擴增反應首先在離心管中進行，在進行過程中, CRISPR體系試劑將在管蓋內保持相對穩定。當LAMP擴增反應完成后, CRISPR體系試劑通過人為混勻進入LAMP擴增后的體系中，并進行核酸檢測，然后對反應混合物進行熒光成像檢測，故本方法可以有效減少氣溶膠污染。

本研究建立的方法檢測了50例經確診的臨床樣本，其中有30例為陽性, 20例為陰性，結果均與PCR結果一致,Kappa值為1, 表明2種方法一致性很好。此方法檢測FluA、FluB、Kp、Sp反應均為陰性，顯示其具有高特異性。但本法存在以下3點不足: ① 由于LAMP反應的溫度為65 ℃, 此溫度對CRISPR體系中的Cas12a、crRNA 和ssDNA report 3種試劑產生影響的程度以及是否對最終實驗結果產生影響，本研究將會在后續的實驗中逐步加以驗證。② 在此法評價靈敏度時，本研究實驗結果為10 fg/μL, 實際的檢測限應該小于10 fg/μL, 后續本研究將會評價10 fg/μL至1 fg/μL之間的其他濃度，以期找到此法“真實”的檢出限。③ 在此法評價特異性時，本研究選取了除Mp外4種病原體，仍不夠全面，在后續的實驗中本研究將會增加引起呼吸道感染的其他病原體，繼續探究本檢測方法的特異性。此外檢測臨床樣本僅有50例，存在偶然性及片面性。

綜上所述，本研究將LAMP的強大病原體擴增優勢與CRISPR-Cas12a對Mp DNA特異性檢測能力相結合，建立了單管一步法檢測Mp的方法，該法簡便、快速，檢測過程中無需開蓋、無氣溶膠污染，并可在1 h后可讀取結果; 檢測靈敏度達到了10 fg/μL, 且特異性強不受其他病原體干擾，不需要高端復雜的設備。CRISPER-LAMP單管一步法有望成為檢測Mp的新手段，可為社區及基層醫院廣泛檢測Mp提供新方法。