萱草屬DUS測試中數(shù)量性狀的測量方法研究

褚云霞 何玉祥 鄧 姍 陳海榮* 任 麗 章毅穎 趙 洪 李壽國

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(上海)分中心，上海 201415;3.上海市設施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403；4.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，南昌 330045)

《中國植物志》中記載，萱草屬(

Hemerocallis

)植物約有14種，我國有11種，在各地均有分布，其中萱草(

H.fulva

)又名忘憂草，分布最廣。我國種植萱草屬植物的歷史超過了2 000年。萱草屬種質(zhì)資源豐富，種間很容易雜交，據(jù)此Corliss認為在理論上人類可創(chuàng)造出2 321億多萱草品種。20世紀以來，國外培育出大量優(yōu)質(zhì)雜種萱草，其中許多優(yōu)良品種是用我國萱草原始種雜交培育而成，目前萱草品種已達上萬種。

對萱草屬種質(zhì)資源進行調(diào)查與分類，是進一步開發(fā)、利用與創(chuàng)新的基礎。萱草屬種質(zhì)資源研究主要涉及分類學、細胞學、孢粉學、生物化學和分子生物學等，其中分類學主要基于形態(tài)性狀，而形態(tài)性狀依據(jù)其特性又被分為數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀和假質(zhì)量性狀3種類型。數(shù)量性狀是指能在一維的、連續(xù)或不連續(xù)的線性尺度上記錄的性狀，多基因假說認為，生物體的數(shù)量性狀受微效多基因控制，因此數(shù)量性狀易受環(huán)境因素影響。同時眾多研究表明，播種期、測量時期和部位及測量方法等都會對其產(chǎn)生較大的影響，因此在品種分類中較少使用數(shù)量性狀，但是萱草屬的植株大小和花葶高度等數(shù)量性狀卻是重要的分類性狀。龍雅宜等曾將花色作為第一分類標準，并用花葶高度、有無莖芽和是否二次開花等性狀對多倍體品種進行分類。杜娥等借鑒二元分類法，通過倍性(二倍體和四倍體)、植株大小(大型、中等型和小型)、綠期長短(休眠群、常綠群和半常綠群)、開花期(早期開花和中期開花)和花直徑(大型花、小型花和微型花)5個分類標準，將引進的21個大花萱草品種分為2類4型8個品種群。萓草屬的國際品種登錄時也要求提供植株大小和花徑等測量數(shù)據(jù)。數(shù)量性狀在其他方面也有重要的作用，如花數(shù)量是觀賞品質(zhì)評價的重要標準，株高、花徑和花數(shù)量是引種表現(xiàn)評價中的生長評價指標，品種描述時也少不了株高、花數(shù)量和花徑等數(shù)量性狀，遺傳多樣性分析和倍性育種等也離不開數(shù)量性狀。

我國擁有豐富的萱草屬野生資源，但對于育種工作的重視程度遠遠不夠。通過傳統(tǒng)方式培育出了不少新品種，但優(yōu)良品種為數(shù)不多，園林綠化使用的萱草仍多是國外引進品種。引進國外的品種對發(fā)展我國園林綠化起到重要的作用，但是一味依賴進口即不利于我國花卉業(yè)的長遠發(fā)展和水平提高，也浪費了本國的豐富野生資源。為了鼓勵我國萱草屬育種，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將萱草屬納入了保護名錄，并于2014年頒布了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 萱草屬》行業(yè)標準，指南含有35個基本性狀，3個選測性狀，其中13個數(shù)量性狀需進行個體測量，而花葶長度和花直徑更是作為分組性狀，用于指導品種分組，可見在萱草屬特異性、一致性和穩(wěn)定性測試(Tests for distinctness, uniformity and stability, 簡稱DUS測試)中數(shù)量性狀的準確測量意義重大，是特異性判別結(jié)果的科學性和客觀性的保證。

本研究通過比對不同定植時間、測量時期和觀測部位等因素對萱草屬DUS測試中的個體測量數(shù)量性狀的影響，旨在確定適宜的測量方法，盡量減少環(huán)境和人員差異對數(shù)量性狀的影響，提升數(shù)量性狀的觀測效率和質(zhì)量，以期指導測試實踐，并為育種研究指供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年收集16個品種的休眠根狀莖，其中‘金娃娃’和‘紅運’根狀莖于2016年12月26日和2017年1月19日各定植1次，‘丹陽’‘紅運’‘楚楚’和‘紫蝶’4個品種的根狀莖于2017年1月19日和2017年3月14日各定植1次，其它品種于2017年1月19日定植。行距40 cm，株距40 cm，每品種種植不少于30株，所有材料均露地種植于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(上海)分中心。定植后原地越冬，不進行分株繁殖。連續(xù)3年(2017年、2018年和2019年)的5—8月進行性狀觀測。2018年收集14個品種休眠根狀莖于2018年2月8日定植，分別于2018年和2019年的5—8月進行性狀觀測。

表1 供試材料表

Table 1 varieties used in this study

序號Number品種名Nameofvariety收集年份Collectingyear來源 Source 1金娃娃H.fulva‘GoldenDoll’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院2紫泉H.fulva‘PurpleWaters’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院3寒笑H.fulva‘Hanxiao’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院4回復H.fulva‘PardonMe’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院5十里紅妝H.middendorfii‘Shilihongzhuang’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院6詹姆士馬斯H.‘JamesMarsh’2016年寧波市農(nóng)業(yè)科學院7夢幻H.‘Dream’2016年河北省林業(yè)科學研究院8丹陽H.‘Danyang’2016年河北省林業(yè)科學研究院9紅運H.‘Redluck’2016年河北省林業(yè)科學研究院10楚楚H.‘Chuchu’2016年河北省林業(yè)科學研究院11紫蝶H.‘Littlebumblebee’2016年河北省林業(yè)科學研究院12常綠萱草H.fulva‘Aurantiaca’2016年無錫古莊美尚生態(tài)苗圃有限公司13金光大道H.‘FransHals’2016年無錫古莊美尚生態(tài)苗圃有限公司14紅寶石H.‘Ruby’2016年無錫古莊美尚生態(tài)苗圃有限公司15大花萱草H.middendorfii2016年無錫古莊美尚生態(tài)苗圃有限公司16雙色火焰H.‘Shuangsehuoyan’2016年無錫古莊美尚生態(tài)苗圃有限公司17H.‘VER00112’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司18冰雪狂歡H.‘IceCarnival’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司19H.‘VER00198’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司20H.‘VER00323’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司21H.‘VER00204’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司22H.‘VER00213’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司23H.‘VER00322’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司24H.‘FransHals’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司25H.‘LongfieldsPearl’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司26H.‘StrawberryCandy’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司27H.‘WildMustang’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司28H.‘LongfieldsButterfly’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司29H.‘LittleAnneRosa’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司30H.‘PrettyFancy’2018年荷蘭希姆思科宿根花卉公司

1.2 方法

按照《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 萱草屬》(NY/T 2584—2014)進行性狀觀測(表2)，每品種觀測10株，在觀測植株的器官或部位時，每個植株的取樣數(shù)量為1。

表2 萓草屬DUS測試觀測性狀表

Table 2 The characteristics observed in DUS tests of daylily

編號Code性狀 Characteristic 類型Type編號Code性狀Characteristic類型TypeCh1葉叢姿態(tài)PQCh20外花被片邊緣波皺QLCh2葉叢高度QNCh21外花被片花肋QLCh3葉叢直徑QNCh22僅適用有花肋的品種:外花被片花肋顏色PQCh4葉片綠色程度QNCh23內(nèi)花被片長度QNCh5葉片長度QNCh24內(nèi)花被片寬度QNCh6葉片寬度QNCh25內(nèi)花被片反卷程度PQCh7花葶長度QNCh26內(nèi)花被片主要顏色PQCh8花葶粗度QNCh27內(nèi)花被片顏色程度QNCh9花葶分枝QNCh28內(nèi)花被片斑QLCh10花苞片QLCh29僅適用有花斑的品種:內(nèi)花被片斑顏色PQCh11花數(shù)量QNCh30內(nèi)花被片邊緣波皺QLCh12花形狀PQCh31僅適用于有邊緣波皺的品種:內(nèi)花被片邊緣波皺程度QNCh13花型PQCh32僅適用于有邊緣波皺的品種:內(nèi)花被片彩緣QLCh14花重瓣性QNCh33內(nèi)花被片花肋QLCh15花直徑QNCh34僅適用于有花肋的品種:內(nèi)花被片花肋顏色PQCh16花顏色數(shù)量QNCh35始花期QNCh17花眼PQCh36葉片數(shù)量QNCh18外花被片主要顏色PQCh37外花被片長度QNCh19外花被片斑QLCh38外花被片寬度QN

注：QN指數(shù)量性狀，QL指質(zhì)量性狀，PQ指假質(zhì)量性狀。

Note: QN refers to quantitative characteristic，QL refers to qualitative characteristic，PQ refers to pseudo-qualitative characteristic.

2019年以部分2018年定植品種為觀測對象，分別于營養(yǎng)生長期和盛花期對葉相關(guān)性狀進行測量，探討生長階段對測量結(jié)果的影響。在花序開放過程中，測量花葶長度、花葶粗度和花數(shù)量，同時測量正在開放的花直徑等花相關(guān)數(shù)量性狀，探討花序開放程度對花序及花相關(guān)數(shù)量性狀測量的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL進行

T

-測驗分析，比較觀測值間的差異(

P

<0.05)。性狀間的相關(guān)性分析是將測量值按標準品種調(diào)整后的分級標準轉(zhuǎn)換成代碼，用軟件SPSS 25.0進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同定植時間對數(shù)量性狀的影響

不同定植時間對第1生長季觀測數(shù)量性狀的影響見圖1。可以看出，定植時間不同主要影響葉叢(Ch2和Ch3)、葉片(Ch5和Ch6)和花葶(Ch7和Ch8)3個部位的數(shù)量性狀，不同品種的表現(xiàn)不同。12月種植與翌年1月種植相比(圖(a)和(b))，晚種生長要好于早種，‘金娃娃’的葉叢高度(Ch2)、葉叢直徑(Ch3)及葉片長度(Ch5)測量值都大于12月種植的觀測值(

P

值分別為0.049 9、0.012 3和0.000 2)。1月種植的‘紅運’的葉叢直徑、葉片寬度、花葶長度、花葶粗度、內(nèi)花被片長度、內(nèi)花被片寬度、葉片數(shù)量、外花被片長度和外花被片寬度測量值均大于12月種植的測量值(P值分別為0.000 6、0.004 4、0.015 4、0.002 9、0.044 4、0.000 000 6、0.000 005、0.025 8、0.009 9)。3月種植與1月種植相比(圖(c)～(f))，葉片長度和寬度及內(nèi)、外花被片寬度受影響較小，4個品種中均無明顯差異，大部分品種中花相關(guān)數(shù)量性狀比較穩(wěn)定，只有‘楚楚’花直徑明顯變小，而‘紫蝶’的內(nèi)、外花被片長度均變長，‘丹陽’花數(shù)量明顯變少。另外晚種明顯影響花葶長度，除‘紫蝶’外，3個品種中花葶明顯變短。

2.2 不同測量時期對葉相關(guān)數(shù)量性狀的影響

選擇花期不同，花數(shù)較多的3個品種‘VER00198’(5月中旬開花)、‘VER00323’(5月下旬開花)和‘Longfields Pearl’(6月上旬開花)為觀測對象，對比營養(yǎng)生長期與盛花期測量值的差異。從圖2可以看出，營養(yǎng)生長期測量的葉叢高度、葉叢直徑、葉片長度、葉片寬度和葉片數(shù)量5個性狀與盛花期測量值略有差別，但均未達到顯著差異。

2.3 不同生長年齡對數(shù)量性狀觀測的影響

連續(xù)3年的數(shù)量性狀觀測表明(圖3僅展示3個代表品種)，所有品種第2個生長季葉叢高度、葉叢直徑、葉片長度、葉片寬度、花葶長度、花葶粗度和花數(shù)量均明顯高于第1個生長季觀測值，而花直徑則在‘金娃娃’等5個品種中第2個生長季觀測值大于第1個生長季觀測值，在其它11個品種中則無明顯差別；內(nèi)花被片長度、內(nèi)花被片寬度和外花被片寬度在大多數(shù)品種中2年觀測值無明顯差異，總體說所有數(shù)量性狀第2個生長季觀測值均大于或等于第1個生長季測量值。而第3個生長季的表現(xiàn)則比較復雜，有的品種如‘金娃娃’中，與第2個生長季相比，葉叢高度繼續(xù)增大，但葉叢直徑減小，內(nèi)花被片長度和外花被片長度減小到與第1個生長季類似，葉片長度等其它性狀基本保持不變；‘紫泉’的所有數(shù)量性狀第3個生長季觀測值與第2個生長季觀測值均無明顯差異；‘寒笑’中則除葉片長度明顯變長外其它大部分性狀后2年結(jié)果無明顯差異。總體來說所有品種大部分性狀第3個生長季觀測值均等于或小于第2個生長季的觀測值，可見定植后第2個生長季為萱草的最佳觀測時期。

2.4 不同部位花對花相關(guān)數(shù)量性狀測量的影響

選擇單個花序上花數(shù)量多于13朵的4個品種‘VER00112’‘VER00198’‘VER00204’和‘VER00323’，在每朵花開放時測量花序相關(guān)性狀及花相關(guān)性狀，第1朵花開放時測量值記錄為1花數(shù)據(jù)，第2朵花開放時獲得的測量值記為2花，以此類推，結(jié)果匯總成表3。從結(jié)果可以看出，花葶長度、花葶粗度和花數(shù)量相對較穩(wěn)定，其測量值基本無顯著差異；其余5個性狀均有隨著花向上開放而不斷變小的趨勢，變化最明顯的是外花被片寬度，平均減小了33.5%，其次是花直徑(26.6%)，隨后分別是內(nèi)花被片寬度(23.6%)、外花被片長度(20.8%)和內(nèi)花被片長度(17.4%)。測量前3朵花時除內(nèi)花被片長度外所有的數(shù)量性狀均無明顯差異，而第3朵的內(nèi)花被片長度比第1朵的內(nèi)花被片長度約小0.20 cm,遠小于DUS測試時的內(nèi)花被片的級差(1.70 cm，數(shù)據(jù)未顯示)。

2.5 數(shù)量性狀間的相關(guān)性分析

去除沒有多態(tài)性的花苞片、花重瓣性、內(nèi)花被片斑顏色和內(nèi)花被片邊緣波皺4個性狀后用30個品種觀測數(shù)據(jù)進行性狀間相關(guān)性分析(表4)。從表4中可以看出，所有數(shù)量性狀與2～11個其他性狀間存在顯著相關(guān)，如葉叢高度與葉片長度顯著正相關(guān)，與內(nèi)花被片顏色程度顯著負相關(guān)；葉叢直徑與葉片長度及內(nèi)花被片主要顏色極顯著正相關(guān)，與外花被片花肋顯著正相關(guān)；葉片長度則與葉叢直徑、花葶長度、花直徑、內(nèi)花被片長度共4個性狀極顯著正相關(guān)，與葉叢高度、花形狀和外花被片長度等7個性狀顯著正相關(guān)；葉片寬度與花葶粗度、內(nèi)花被片長度、內(nèi)花被片寬度及外花被片寬度共4個性狀極顯著正相關(guān)，與花數(shù)量、花直徑和外花被片長度等6個性狀顯著正相關(guān)；花葶長度與葉片長度、花形狀極顯著正相關(guān)，與內(nèi)花被片長度和外花被片長度顯著正相關(guān)；花直徑與葉片長度、花葶粗度、內(nèi)花被片長度、內(nèi)花被片寬度、外花被片長度和外花被片寬度共6個極顯著正相關(guān)，與葉片寬度及始花期顯著正相關(guān)。

通過Uniqueness軟件(https:∥github.com/corteva)計算，僅需花葶長度、花直徑和葉片數(shù)量3個數(shù)量性狀就能區(qū)分所收集的30個品種，而這3個性狀無顯著相關(guān)關(guān)系，可見萱草數(shù)量性狀具有較強的區(qū)分品種能力。

2.6 通過其他性狀推測花直徑的可行性

通過2年的觀測，發(fā)現(xiàn)所收集的品種花直徑與外花被片長度代碼相同或相差1個代碼，線性回歸分析發(fā)現(xiàn)

R

值可達0.893。如果加入性狀花型后，

R

值可達0.933。為進一步提高預測的準確性，加入所有與花直徑顯著相關(guān)的性狀及花型后進行線性回歸，獲得回歸方程：花直徑=-2.138+0.765×花型+1.440×外花被片長度+0.473×外花被片寬度+0.017×葉片長度+0.252×葉片寬度-0.107×花葶粗度-0.046×內(nèi)花被片長度-0.174×內(nèi)花被片寬度-0.107×始花期(

R

=0.945)。

通過SPSS自動線性模型對所有性狀的貢獻率進行排序(見表5)，發(fā)現(xiàn)預測花直徑時貢獻率從大到小依次為：外花被片長度>內(nèi)花被片長度>花葶粗度>內(nèi)花被片寬度>外花被片寬度>葉片長度>始花期>葉片寬度>花型。

表5 各性狀在預測花直徑中的貢獻率

Table 5 Predictor importance of characteristics on flower diameter

性狀Characteristic貢獻率/%Predictorimportance花型Flowertype0.58葉片寬度Widthofleaf1.97始花期Beginningofthefloweringstage3.73葉片長度Lengthofleaf4.60外花被片寬度Widthofouterperianth6.24內(nèi)花被片寬度Widthofinnerperianth6.54花葶粗度Scapethickness7.57內(nèi)花被片長度Lengthofinnerperianth34.05外花被片長度Lengthofouterperianth34.72

3 討 論

《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 萱草屬》(NY/T 2584—2014)中要求萱草屬DUS測試至少為1 個獨立的生長周期。關(guān)于生長周期的理解不同植物中差異較大，生長周期一般指從播種開始，經(jīng)生長、發(fā)育、開花、結(jié)果至衰老和死亡的全過程，而多年生植物的生長周期則復雜得多，落葉植物每年會重復萌芽、生長和休眠的過程，因此通常認為1個生長周期為1次萌芽到休眠的全過程。但有的多年生植物如果樹，通常有個幼年期，因此DUS中的生長周期并不等同于年生活周期。萱草為多年生草本植物，多以分株進行繁殖，一般分株的萱草第一個生長季就能開花，因此有人認為一個生長季即可完成萱草的DUS測試。涉及形態(tài)性狀觀測的萱草品種評價和品種描述的研究并未明確觀測對象的苗齡，本研究發(fā)現(xiàn)葉叢高度、葉叢直徑和葉數(shù)量等性狀第1個生長季的觀測值都明顯小于第2個生長季觀測值，推測分株、運輸及定植造成的損傷影響到了性狀的充分表達。因此認為對于萱草1個獨立的DUS生長周期應該從休眠根狀莖定植后到第2個生長季開花結(jié)束。

萱草英文名Daylily，即“一日百合”，指其單朵花僅完全開放1天就會凋萎。在萱草測試中，經(jīng)常會錯過第一朵開放的花，而且環(huán)境條件不利，如連續(xù)陰雨天，可能導致花無法正常開放，甚至顏色發(fā)生改變，因此在萱草屬DUS測試指南中，未規(guī)定要觀測哪一朵花，僅要求觀測發(fā)育健全且具有典型形態(tài)的花。多數(shù)萱草屬植物具總狀花序或圓錐花序，花由下到上不斷開放，后開的花同樣具有典型形態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)以不同部位的花為觀測對象，所獲得的測量值具顯著差異，特別是外花被片寬度，為了準確進行花相關(guān)性狀觀測，減小測量誤差，需限定觀測部位，從結(jié)果看，對于大多數(shù)品種，前3朵正開放的花都適于花相關(guān)性狀采集。

一般認為，數(shù)量性狀容易受環(huán)境影響，其測試性能弱于質(zhì)量性狀和假質(zhì)量性狀，但數(shù)量性狀也具有客觀、容易獲取和重復性強等特點。有研究認為某個性狀與其他性狀關(guān)系越密切，對其它性狀的代表能力越強，區(qū)分品種的能力也越強。萱草屬DUS測試中個體測量的所有數(shù)量性狀均與2～11個其他性狀間存在顯著相關(guān)，因此有較強的品種區(qū)分能力。如果不考慮測量的數(shù)量性狀，則需結(jié)合花顏色數(shù)量、花眼、外花被片主要顏色、內(nèi)花被片顏色程度和始花期5個性狀才能完全區(qū)分所有品種，本研究僅需3個測量的數(shù)量性狀就能達到同樣的目的。

萱草定植后，許多性狀的第3個生長季觀測值均等于或小于第2個生長季的觀測值，而生產(chǎn)中一般3～4年后才需進行更新復壯，可能是由于測試指南規(guī)定的株行距較小(生產(chǎn)上一般株行距為0.5 m×1.0 m)。隨著根狀莖的生長，芽越來越多，生長空間不足已嚴重影響到植株性狀正常表達，為了確保植株生長良好，性狀充分表達，應每2年進行分株繁殖或者增大定植植株行距。

4 結(jié) 論

經(jīng)過3年的連續(xù)觀測，結(jié)果表明休眠期定植萱草根狀莖，第1個生長季可以開花，但許多數(shù)量性狀不能正常表達，第2個生長季的表現(xiàn)才能充分反映品種特性。為了簡化測試，葉相關(guān)數(shù)量性狀可以改在盛花期測量，花相關(guān)數(shù)量性狀需測量前3朵正在開放的花。所有數(shù)量性狀與其它2～11個性狀間存在相關(guān)性，結(jié)合3個測量的數(shù)量性狀就能區(qū)分所收集的30個品種，通過外花被片長度和花型等性狀可以推測花直徑。