間充質干細胞治療支氣管肺發育不良作用機制的研究進展

謝可瑾 董明月 白靜萱 綜述 岳冬梅 審校

（中國醫科大學附屬盛京醫院兒內科，遼寧沈陽 110004）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD），又稱新生兒慢性肺疾病，是早產兒嚴重并發癥之一。盡管積極采取應用肺表面活性物質［1］、咖啡因［2］、糖皮質激素［3］和肺保護性通氣策略［2］等治療措施，BPD發生率仍呈現逐年升高趨勢［4-5］。隨著圍生醫學的不斷進步，早產兒特別是超早早產兒（胎齡22～28周）存活率增加［6］。尚處于小管期或囊狀期的早產兒肺無法維持正常發育，出現肺泡發育簡化［7］，血管生成異常和氣道平滑肌重塑等肺損傷［8］。BPD致病因素較多，包括母體因素［9-10］、機械通氣［11］、感染［12］、炎癥［13］、氧化應激［14］、營養不良［15］、表觀遺傳因素［16］等，目前尚缺乏有效的干預措施來預防或治療該疾病。近年來，細胞治療在早產兒肺修復中具有重要前景［17］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其獨特的免疫逃避和多效性作用［18］，有望成為治療BPD的優勢方式。

1 MSCs的概述

MSCs是具有自我更新能力的多能非造血干細胞，由Caplan［19］在20世紀80年代首次命名。在隨后的10年中有研究發現，在適當的生長因子和化學刺激物的作用下，MSCs在體外沿著不同的中胚層譜系分化成骨、軟骨和脂肪的間充質細胞系［20］。2006年，國際細胞治療協會制定了鑒定MSCs的最低標準，即在體外培養時，MSCs表現為具有黏附性的，向軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞分化能力的，以及表達一組表面標記物的集落形成細胞［21］。大量的臨床前試驗證明MSCs具有改善組織損傷和修復器官功能的能力。MSCs治療成人疾病的臨床試驗已經開展，其在急性肺損傷［22］、克羅恩病［23］、糖尿病［24］等疾病中的治療作用已被證實。同時Chang等［25］也證實了MSCs治療早產兒BPD的安全性和可行性。越來越多的研究表明，MSCs不僅具備自我更新和多向分化潛能，其分泌性作用更值得關注，更有Caplan［26］建議可以將MSCs命名為“藥物信號細胞”。

2 MSCs治療BPD的作用形式

2.1 MSCs的組織替代

MSCs在體內行為的自然模型［27］表明它們可以通過膜和組織遷移到受損部位。MSCs歸巢到靶組織是一個多步驟的過程，包括在血液中以血栓形式流動、激活內皮細胞、阻滯整合素、重塑基底膜，沿趨化因子濃度梯度遷移［28］。值得注意的是，無論是否存在肺特異性損傷，大多數靜脈注射MSCs在第1次通過循環時通常會駐留在肺微血管中，僅一小部分分布到其他部位［29］。然而多項臨床前研究發現，目前所觀察到的MSCs在肺中的植入率僅在0%～20%之間［30］。已有實驗數據顯示，在給予新生大鼠BPD模型人MSCs 18 d后，僅在鼠肺少量細胞內檢測出人β2-微球蛋白，在4 d內幾乎檢測不到人類Alu序列［31］。低細胞移植率提示MSCs不能僅通過分化為替代細胞類型或細胞融合修復受損或死亡的細胞來治療BPD。

2.2 MSCs的旁分泌

MSCs可通過釋放多種生長因子、抗炎因子、免疫調節因子［如肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、前列腺素E2、腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白（tumor necrosis factor-stimulated gene-6 protein，TSG-6）、胰島素樣生長因子1、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等］、線粒體及含有蛋白質和RNA的細胞外囊泡到肺損傷部位，促進組織修復和功能恢復［32］。

2.2.1 MSCs細胞外囊泡MSC衍生的細胞外囊泡（MSC-derived extracellular vesicles，MSC-EVs）通過運載生物活性信號分子穿梭于細胞之間或直接激活受體細胞的信號通路來介導細胞內的通訊［33］。細胞外囊泡根據直徑大小可分為：外泌體（30～100 nm）、微泡（100～1 000 nm）和凋亡小體（1 000～5 000 nm）；國際細胞外囊泡協會現在建議使用“細胞外囊泡”概括描述所有大小的囊泡，并推薦根據理化特性或起源條件來代替單純基于直徑大小的分類方式［34］。細胞外囊泡表達與來源細胞相似的細胞表面蛋白，并含有多種細胞質成分，包括蛋白質、RNA（包括mRNA和非編碼RNA，如microRNA）、脂質、線粒體和DNA等［33］。MSC-EVs被認為是MSCs修復肺損傷的關鍵治療因子。Leeman等［35］認為，MSC-EVs攜帶的分泌因子可能通過在損傷后替換有缺陷的信號從而觸發內源性上皮細胞修復損傷來治療BPD。Chaubey等［36］在新生BPD小鼠模型中證實，臍帶來源的MSCEVs可改善肺部炎癥，緩解肺動脈高壓和右心室肥厚。Willis等［37］認為MSC-EVs不僅可以在新生兒期有效預防BPD的發展，還可以為已確診BPD患兒的兒童期管理和逆轉心肺并發癥提供有益的作用。

2.2.2 MSCs通過線粒體轉移的修復能力近年來，有研究在MSCs分化和維持過程中觀察到線粒體的重塑，推測線粒體參與調控移植后MSCs的自我更新和多向分化［32］。同時線粒體轉移也是MSCs再生和修復受損細胞或組織的一種發生機制。它可以改變MSCs作用微環境，恢復受損細胞的生物能量需求，促進MSCs發揮修復作用。線粒體的轉移途徑包括隧道納米管、囊泡、縫隙連接、細胞融合等。在體外培養中，隧道納米管和囊泡較其他兩種形式更容易被觀察到［32］。損傷細胞的局部微環境改變，如線粒體受損、線粒體DNA和線粒體產物的釋放及活性氧水平的升高，都會觸發線粒體捐贈，即線粒體從MSCs向受體細胞轉移［38］。有研究證實，MSCs通過隧道納米管傳遞的線粒體增強了巨噬細胞的吞噬作用，同時調節免疫應答能力［39］。在誘導急性肺損傷的小鼠模型中，MSCs通過將線粒體轉移到肺泡上皮細胞發揮修復肺損傷作用［40］。

3 MSCs治療BPD的作用機制

3.1 MSCs免疫調節及抗炎作用

當MSCs暴露于炎癥環境中時，通過釋放多種介質，如免疫抑制分子、外泌體、趨化因子、補體和各種代謝物，協調局部和全身的免疫反應。一項評估早產兒異基因人臍帶血衍生MSCs移植的安全性和可行性研究中，MSCs移植后第7天患兒氣管抽吸液體中IL-6、IL-8、TNF-α等相關炎性因子明顯減少［25］。高氧新生小鼠肺中促炎“M1”巨噬細胞增多，抗炎“M2”巨噬細胞減少。經腹腔注射MSCs，小鼠肺中M1/M2平衡恢復到常氧水平，高氧肺損傷得到修復［41］。有研究指出，這種巨噬細胞極化可能受MSCs分泌的核心蛋白聚糖與巨噬細胞上的CD44相互作用的調控［42］。MSCs分泌的TSG-6是一種多功能蛋白，受促炎刺激而分泌增加，可降低BPD小鼠促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的產生［36］。TSG-6還可與CD44結合，調控巨噬細胞極化，并抑制中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞浸潤到炎癥組織［43］。另有研究認為，MSCs分泌的在小鼠肺損傷模型中起治療作用的因子，吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）也參與了調控TSG-6的抗炎能力［44］。

3.2 MSCs促血管生成作用

炎癥信號刺激MSCs產生多種生長因子，VEGF、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子等［45-47］，這些生長因子可以激活常駐干細胞的再生潛能，促進血管生成和基質重塑。VEGF在MSCs誘導的血管生成中起著核心作用［48］。在嚙齒類動物模型中［49］，高氧引起肺部內源性VEGF水平下降，給予MSCs后VEGF下降減緩。VEGF通常由Ⅱ型肺泡細胞產生，刺激內皮細胞促進血管形成，引導上皮細胞成熟和增殖，參與肺小管和囊狀形成［50-51］。在死于BPD的患兒肺中檢測到VEGF低表達［52］。VEGF的調控被認為是預防和治療BPD的一個可行性策略。然而Kuchroo等［53］在人臍帶MSCs條件培養液中卻未檢測到VEGF，推測觀察到的高水平的基質金屬蛋白酶-2可能與VEGF非依賴途徑血管生成反應有關。Reiter等［54］的一項研究表明，在BPD的嚙齒動物模型中，介導肺再生的基質細胞衍生因子-1增強了促血管生成作用。Shen等［55］發現，臍帶來源的MSCs促血管生成的有效旁分泌因子是一個大的復合體，除了有VEGF、胰島素樣生長因子1外，還分泌不同的細胞因子和趨化因子，如單核細胞趨化蛋白1和HGF等。

3.3 MSCs抗氧化活性

氧化應激在BPD的發病過程中起主要作用。高濃度氧引起肺的非特異性改變，在體內形成的高活性氧自由基，是BPD發病的關鍵炎癥介質［56］。骨髓MSCs通過清除自由基和提供線粒體直接或間接地上調其他細胞的抗氧化防御能力及改變細胞生物反應。同時MSCs的免疫抑制特性也可以避免氧自由基的產生。轉錄因子核因子E2相關因子2與其主要的負調節因子Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1一起，形成了一個分子效應器和傳感器系統，對干擾細胞氧化還原平衡的因素作出強有力的反應。MSC-EVs攜帶的miRNA激活核因子E2相關因子2，表達高水平的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶，維持氧化-抗氧化平衡［57-58］。此外，細胞在氧化應激和炎癥狀態下釋放的活性氧也被認為觸發了線粒體的轉移，同時MSCs通過降低線粒體氧自由基和電子轉運鏈復合物的活性逆轉氧化應激狀態。目前，MSCs抗氧化作用已被證實可以改善多種器官損傷，如腸道［59］、腦部［60］和腎臟［61］等。另有研究指出，骨髓MSCs的短暫高氧預處理可增加抗氧化劑錫鈣素-1的產生，通過阻斷解偶聯蛋白2來減輕氧化應激，并增強BPD嚙齒類動物模型的肺保護作用［62］。

3.4 MSCs對肺纖維化的影響

2019年的一項臨床研究在對4名給予臍帶MSCs移植的BPD患兒的隨訪中發現，4名患兒均從BPD中恢復，并且胸部影像學檢查證實肺纖維化逐漸減少［63］。肺纖維化的特點是細胞外基質過度沉積，尤其Ⅰ型膠原廣泛積聚，肺實質和上皮屏障破壞，成纖維細胞和肌纖維母細胞增生［64］。存活的BPD患兒的肺部病理表現出明顯的纖維化特征［65］。慢性炎癥是纖維化的主要驅動因素，骨髓MSCs通過減少巨噬細胞和B淋巴細胞的過濾和抑制腫瘤壞死因子等促炎因子的表達來改善組織纖維化［66］。在博來霉素誘導的小鼠肺損傷模型中，來源于臍帶組織的MSC-EVs可以通過增加HGF來減輕肺纖維化［67］。TGF-β是肺纖維化的主要調節因子，是MSCs抗肺纖維化治療的主要靶點之一。MSCs通過Wnt信號通路降低了TGF-β的表達［68］。在過敏性氣道炎癥小鼠模型中，MSCs通過阻斷TGF-β/Smad信號通路而減輕氣道炎癥和防止氣道重塑［69］。TGF-β還通過調節基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡來增強基質蛋白的合成。有研究表明，HGF可以通過抑制TGF-β的表達并增加基質金屬蛋白酶濃度來改善膠原降解能力［70］。最近有報道稱，骨髓MSCs分泌的錫鈣素-1通過減少成纖維細胞分泌膠原，減少內皮細胞分泌TGF-β從而發揮抗纖維化作用［71］。不難看出，MSCs可以改善細胞外基質的質量，使其形成有利于組織再生的微環境，從而減少組織纖維化，增加常駐干細胞增殖，并最終導致組織再生。

3.5 肺內MSCs與BPD

肺內MSCs（lung-resident MSCs，L-MSCs）通過調控肺泡間隔和血管化的過程在肺發育中起著協調器的作用。在嚙齒動物中，L-MSCs分化為肺成纖維細胞群的祖細胞，通過誘導靶向分化促進早期器官發育。在生理環境下，人類胎兒肺在充滿液體的低氧子宮環境中發育生長。胎兒肺內含有大量的L-MSCs，低氧環境使L-MSCs保持著多能性和增殖潛力，促進肺內皮細胞和上皮細胞成熟，調控正常肺發育。早產不僅會中斷肺的成熟過程，同時在氧化應激和炎癥等病理生理環境下，L-MSCs出現活力減低、紊亂或凋亡。Popova等［72］提出L-MSCs可能參與了BPD的病理過程，通過測定早產兒出生后第1周的氣管抽吸物中L-MSCs水平可預測BPD的發展。然而L-MSCs是BPD修復過程的一部分還是BPD的關鍵致病因素，仍然是一個有待探究的問題。而外源性MSCs是否可以通過改善L-MSCs微環境而激活其修復能力也許可以成為下一個熱點話題。

4 總結

MSCs通過組織替代、旁分泌及線粒體作用等方式參與免疫調節、抗炎、抗氧化、抗纖維化、促進血管生成等作用。2014年首次報道了MSCs治療BPD的成功案例［25］，并在接下來的短期隨訪中發現MSCs似乎是安全的，該病例的長期隨訪仍在進行中［73］。盡管已有臨床試驗驗證了MSCs的治療效果［74］，但更需要大量的臨床前試驗為MSCs的臨床應用提供基礎［75］。并且MSCs是否可以應用于免疫功能異常的早產兒仍是一個值得深入研究的問題。早產兒疾病并不局限于肺部的異常發育，其他系統也因早產易出現嚴重損傷，包括腦損傷、壞死性小腸結腸炎和早產兒視網膜病變等。了解MSCs治療BPD的相關機制也可以為MSCs修復其他器官損傷的研究提供理論基礎和新的思路。