基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的六味地黃湯治療糖尿病的機制研究*

張艷軍，劉曉琴

（1.晉城市中醫(yī)醫(yī)院，山西 晉城 048000；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

糖尿病是因糖代謝異常及胰島素缺乏而引起人體組織功能發(fā)生障礙的一種代謝性疾病，常伴有許多的并發(fā)癥，以高血糖為主要標(biāo)志[1]。長期存在的高血糖會導(dǎo)致眼、腎臟、心臟、血管等的慢性損害、功能障礙[2]。據(jù)最新報道，目前全球成人糖尿病患病率為9.3%[3]；據(jù)估計，到2045年成人糖尿病患病率將達9.9%[4]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）報道，到2030年將會有5.78億成人患糖尿病[5]。糖尿病已成為當(dāng)前威脅人類生命健康的非傳染性疾病之一，然而，糖尿病的發(fā)病機制尚未被完全闡明。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療糖尿病需要長期服用藥物，而降糖藥物有許多不良反應(yīng)及副作用，且很難根治。

中醫(yī)學(xué)認為糖尿病屬“消渴”范疇，且認為其發(fā)生與陰虛燥熱有緊密關(guān)系，糖尿病治法在于補腎養(yǎng)陰。陰虛型消渴的代表方藥是六味地黃湯，其具有安全性高、毒副作用小、治療效果較理想等優(yōu)勢[6]。六味地黃湯處方中包括熟地黃、牡丹皮、山茱萸、澤瀉、山藥、茯苓6味中藥，其中熟地黃是君藥，具有補髓滋陰補腎的功效；山茱萸具有補益肝腎的功效；山藥具有降血糖、補腎、健脾等功效；牡丹皮、澤瀉、茯苓三味藥具有清熱、涼血、利水等功效[7]。有研究[8]表明六味地黃湯可以改善2型糖尿病模型大鼠的胰島素抵抗，可以改善糖尿病發(fā)病過程中存在的葡萄糖代謝異常情況、調(diào)節(jié)血脂[9]，可用于糖尿病、腎炎、神經(jīng)衰弱等患者的治療，廣泛應(yīng)用于臨床，且有良好的治療效果[10]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，藥物對疾病治療的研究已進入到了細胞和基因水平。目前對六味地黃湯治療糖尿病及其并發(fā)癥的臨床研究報道較多，但對其活性成分、藥理作用及治療機制的研究報道較少；傳統(tǒng)的理論因缺少化學(xué)及生物學(xué)的表征，難以和現(xiàn)代科學(xué)融合[11]。因此，本研究著重探討六味地黃湯治療糖尿病的機制，找出其活性成分，并研究其藥理作用及機制。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究工具 數(shù)據(jù)庫和軟件：基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/）；京都基因和基因組百科全書（KEGG，https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）；Strawberry Perl 5.30.2（Perl，http://Strawberryperl.com/）；R語言3.6.3（Lucent Technologies，http://www.r-project.org）；Cytoscape 3.7.2（The Cytoscape Consoritum，http://cytoscape.org）。

1.2 實驗動物 7周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物房溫度（23±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，所用小鼠實驗前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究動物處置符合“3R”原則。倫理批準(zhǔn)編號：JCPH.No20220713001。

1.3 藥物與試劑 六味地黃湯，方藥組成：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g，澤瀉9 g。以上中藥材均購自山西和仁堂中藥飲片有限責(zé)任公司，且經(jīng)杜晨暉教授鑒定為正品。上述藥材煎煮兩次，濃縮為含生藥1 g/mL的藥液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩８咧暳腺徸孕∈蛴刑ū本┥锟萍加邢薰荆绘滊遄艟兀⊿TZ）（批號：WXBD4971V）購自美國Sigma公司；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抗體（批號：CN89330）、p-PI3K抗體（批號：CN89330）、蛋白激酶B（Akt）抗體（批號：AA44161）、p-Akt抗體（批號：AA44161）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：AA64132）均購自Bioworld公司；HRP-羊抗兔IgG（批號：BST16G15B16H55）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號：16F02A12）、廣譜磷酸酶抑制劑混合物（×100）（批號：16L21C83）、增強型RIPA裂解液（批號：16D16B02）均購自博士德生物工程有限公司；Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）（批號：20210311）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器 TGL-20B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）；GeneGnome成像系統(tǒng)（基因有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 糖尿病差異（關(guān)鍵）基因的獲取 利用GEO數(shù)據(jù)庫查找、下載有關(guān)糖尿病的矩陣文件和平臺文件[12]，獲得正常組樣品22個（GSM610904～GSM610925）和實驗組樣品18個（GSM6 10886～GSM610903），利用Perl對其進行整理；使用軟件R對所得樣本進行篩選，繪制糖尿病GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖和火山圖。

2.1.2 六味地黃湯中藥有效成分的獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找熟地黃、山藥、茯苓、牡丹皮、山萸肉、澤瀉的有效成分，篩選條件為生物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18[13]。

2.1.3 六味地黃湯候選靶標(biāo)的獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載六味地黃湯中6味中藥的藥物靶點并進行整理，再用Strawberry Perl 5.30.2軟件進行藥物靶點ID轉(zhuǎn)換。

2.1.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 Strawberry Perl 5.30.2軟件處理藥物靶點ID轉(zhuǎn)換后的表格和差異基因表格，得到network.txt和node.txt兩個準(zhǔn)備文件，Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建六味地黃湯與糖尿病的“有效成分-靶點-疾病”中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓撲分析的構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)來源于以下幾個數(shù)據(jù)庫：DTP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND數(shù)據(jù)庫。運用Cytoscape3.7.2對中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里的所有基因進行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)制作，構(gòu)建之前定義相關(guān)參數(shù)。PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)是一個龐大的網(wǎng)絡(luò)，直接觀察看不出里面的基因或者蛋白，需要進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。再運用Cytoscape 3.7.2中的CytoNCA包進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，以節(jié)點度值（Degree Centrality，DC）＞61、介數(shù)中心度（Betweenness Centrality，BC）＞100為篩選標(biāo)準(zhǔn)，創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)后，最終得到核心網(wǎng)絡(luò)。

2.1.6 GO富集分析、KEGG富集分析 通過R語言，選擇生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個模塊對六味地黃湯中的靶點和糖尿病基因進行GO富集分析、KEGG富集分析；利用Perl語言將六味地黃湯干預(yù)糖尿病的關(guān)鍵靶標(biāo)名稱轉(zhuǎn)換為Entrez ID后，以P＜0.05為篩選條件，運用Cytoscape構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并將信號通路富集結(jié)果可視化。

2.2 動物實驗

2.2.1 造模與分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組8只和造模組32只。正常組小鼠喂食普通飼料，造模組小鼠喂食高脂飼料。飼養(yǎng)10周后，禁食過夜，造模組小鼠按100 mg/kg劑量腹腔注射STZ造模，正常組小鼠腹腔注射同等劑量的檸檬酸緩沖液，1次/d，連續(xù)3 d。注射后測空腹血糖值，以血糖值≥11.1 mmol/L為造模成功條件。將32只造模成功小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、六味地黃湯低劑量組、六味地黃湯高劑量組、二甲雙胍組，每組8只。

2.2.2 實驗給藥 六味地黃湯低、高劑量組小鼠分別灌胃給予六味地黃湯，7.5、15 g/kg；二甲雙胍組小鼠灌胃給予二甲雙胍溶液，250 mg/kg；模型組與正常組小鼠灌胃給予等體積純凈水，1次/d，連續(xù)4周。末次給藥后12 h，10%水合氯醛麻醉小鼠，取腎臟，備用。

2.2.3 Western blotting 法檢測小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白的表達水平 取小鼠腎臟，使用T-PER組織蛋白提取試劑提取蛋白，Bradford法測定蛋白含量，SDS-PAGE法分離30 μg蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，于5%脫脂奶粉中孵育30 min，室溫封閉1 h后，與抗體p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、β-actin（1∶500）在4 ℃孵化過夜；TBST洗膜后，與HRP標(biāo)記兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h。GeneGnome成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析，所得灰度值即為蛋白相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，各組實驗數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖尿病差異（關(guān)鍵）基因 以lgFC≥1、P＜0.05為條件對糖尿病矩陣文件和平臺文件進行處理得到糖尿病的差異基因2 255個，其中上調(diào)基因1 004個，下調(diào)基因1 251個；繪制糖尿病GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖（見圖1A）和GEO數(shù)據(jù)庫差異火山圖（見圖1B）[14]。熱圖中橫坐標(biāo)為組別（C.正常組；T.實驗組），縱坐標(biāo)為基因名稱，其中，紅色、黑色和綠色分別代表高表達、中表達和低表達。火山圖中，lgFC＜0為綠色，表示在實驗組為下調(diào)基因；lgFC=0為黑色，表示正常組與實驗組無差異基因；lgFC＞0為紅色，表示在實驗組為上調(diào)基因；顏色越亮表示基因表達越顯著。差異基因RPS4Y2和RPS4Y1在正常組高表達，在實驗組低表達；差異基因XIST在實驗組高表達，在正常組低表達。（見圖1）

圖1 糖尿病GEO 數(shù)據(jù)庫差異熱圖（A）與火山圖（B）

3.2 六味地黃湯中主要有效成分 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共找到有效成分74個，其中，熟地黃2個、山茱萸20個、山藥16個、牡丹皮11個、茯苓15個、澤瀉10個[15]。（見表1）

表1 六味地黃湯各種中藥有效成分

3.3 六味地黃湯靶標(biāo) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索處方中各個中藥的藥物靶點，并進行中藥復(fù)方靶點整理后，得到584個有效成分和靶點，其中熟地黃34個、山茱萸130個、山藥144個、茯苓30個、澤瀉9個、牡丹皮237個。進行藥物靶點ID轉(zhuǎn)換，得到506個有用結(jié)果，即熟地黃30個、山茱萸108個、山藥122個、茯苓23個、澤瀉9個、牡丹皮214個。

3.4 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共有24個有效成分，30個基因，其中來源于山藥的有效成分最多（9個）；網(wǎng)絡(luò)圖共有53個節(jié)點，其中藥物分子24個、靶點基因29個，共有82條連線；藥物分子中槲皮素（Degree=23）、山奈酚（Degree=12）、β-谷甾醇（Degree=5）度值較大，作用的靶點較多，說明其在治療糖尿病的治療過程中發(fā)揮主要作用。（見圖2、表2～3）

圖2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

表2 六味地黃湯有效成分藥物分子及其度值

表3 六味地黃湯治療糖尿病相關(guān)靶點基因及其度值

3.5 PPI 蛋白相互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓撲分析 利用度值（Degree Centralities，DC）分析之后得到1 402個凝接節(jié)點（見圖3A），以DC（406-61）進行過濾得到170個節(jié)點（見圖3B），創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)，再進行介度中心數(shù)（Betweenness Centralities，BC）分析，以BC（840-150）進行再次過濾處理，創(chuàng)建一個新的子網(wǎng)絡(luò)后，最終核心網(wǎng)絡(luò)存在43個節(jié)點。（見圖3C）

圖3 六味地黃湯治療糖尿病相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)（A）與拓撲網(wǎng)絡(luò)（B、C）

3.6 GO富集分析 研究六味地黃湯對糖尿病的治療作用，以P＜0.05為過濾條件，對藥物和疾病的靶點基因采取GO富集分析，得到結(jié)果有282個條目，包括生物學(xué)過程相關(guān)條目243個、細胞組分相關(guān)條目20個、分子功能相關(guān)條目19個。GO富集分析生物學(xué)過程相關(guān)條目主要有上皮細胞增殖（epithelial cell proliferation）、調(diào)控上皮細胞增殖（regulation of epithelial cell proliferation）、類固醇激素反應(yīng)（response to steroid hormone）等；細胞組分相關(guān)條目主要有頂端等離子體膜（apical plasma membrane）、細胞的頂端部分（apical part of cell）、橫向等離子體膜（lateral plasma membrane）等；分子功能相關(guān)條目主要有蛋白激酶調(diào)節(jié)活性（protein kinase regulator activity）、激酶調(diào)節(jié)活性（kinase regulator activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）等。篩選出P＜0.05生物學(xué)過程的前20個條目、細胞組分的20個條目、分子功能的19個條目制作GO富集分析柱狀圖。（見圖4）

圖4 六味地黃湯相關(guān)靶點的GO 富集分析圖

3.7 KEGG富集分析 KEGG富集分析得到37條通路，篩選前20條作出氣泡圖（見圖5A）；KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中共有20條通路、17個基因；結(jié)果表明基因顯著富集在神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ca2+信號通路和AMPK信號通路等通路上（見圖5B）。

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖（A）與KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（B）

3.8 各組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相對表達量比較 與正常組比較，模型組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，六味地黃湯高劑量組、二甲雙胍組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），六味地黃湯低劑量組小鼠腎臟中p-Akt/Akt表達水平明顯升高（P＜0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組小鼠腎臟中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達Western blotting 圖

圖7 各組小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達量比較 （±s，n=8）

4 討論

本研究通過對六味地黃湯治療糖尿病的靶點進行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，得到六味地黃湯治療糖尿病的關(guān)鍵靶點，包括雌激素受體α基因（ESR1）、雄激素受體（AR）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、內(nèi)表皮生長因子（EGF）、β2腎上腺素受體（ADRB2）、蛋白激酶B（AKT1）等；通過GO富集分析得到六味地黃湯治療糖尿病關(guān)鍵靶點的相關(guān)功能，主要包括上皮細胞增殖、調(diào)控上皮細胞增殖、類固醇激素反應(yīng)、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、激酶調(diào)節(jié)活性等方面；通過KEGG富集分析得到六味地黃湯治療糖尿病的基因顯著富集在神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ca2+信號通路和AMPK信號通路等通路上，初步探討了六味地黃湯治療糖尿病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療機制；通過小鼠體內(nèi)實驗，采用六味地黃湯對糖尿病模型小鼠進行治療，對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果進行驗證，結(jié)果表明，六味地黃湯可升高小鼠腎臟中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達水平，為其進一步研究應(yīng)用提供參考和方向。

2型糖尿病患者會伴隨嚴(yán)重的脂代謝異常，雌激素和ESR1結(jié)合之后可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對絕經(jīng)后婦女糖尿病人群進行雌激素替代治療，發(fā)現(xiàn)其糖耐量升高、胰島素抵抗降低[16-17]。據(jù)報道，腫瘤抑制因子P53（TP53）與肥胖癥有關(guān)[18]。ADRB2可以特異性地與內(nèi)源性配體結(jié)合并被激活，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，在脂質(zhì)代謝和能量消耗中發(fā)揮重要作用[19]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于PI3K/AKT信號通路的核心部位，在調(diào)節(jié)胰島素細胞的刺激反應(yīng)、增進細胞的生存能力和生長發(fā)育中發(fā)揮著不可替代的作用[20]；研究表明AKT1可在能量代謝通路中發(fā)揮作用[21]。胰島素是機體內(nèi)唯一可降低血糖的激素，同時能促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成；PI3KAkt作為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，具有調(diào)節(jié)控制機體中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用[22]；增強PI3K/Akt信號通路的表達可減輕胰島素抵抗[23]。

六味地黃湯中起主要治療效果的中藥是山茱萸和山藥，而六味地黃湯的君藥是熟地黃，二者結(jié)論不統(tǒng)一，出現(xiàn)這種情況的具體原因有待進一步探究。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方中的應(yīng)用處在初期階段，只是對藥物治療疾病的靶點進行預(yù)測，具體的治療效果需要在臨床應(yīng)用中方可得到體現(xiàn)。這進一步說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥中的應(yīng)用有很大的發(fā)展空間。

六味地黃湯治療糖尿病的作用機制可能與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路有關(guān)，可為其進一步研究應(yīng)用提供參考，但更深層次的原理還需繼續(xù)探索。