晚期非小細胞肺癌患者外周血程序性死亡受體1和程序性死亡受體配體1的表達及臨床意義*

戴凡，羅文，夏航彪，鄧燕，肖情，邱容

629000四川 遂寧，遂寧市中心醫院/重慶醫科大學附屬遂寧市中心醫院/川北醫學院附屬遂寧醫院 呼吸與重癥醫學科

肺癌是中國及全球范圍內死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]，按照病理類型可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中NSCLC約占85%[3]。有約80%的NSCLC患者在確診時已處于中晚期，其5年生存率僅17.4%[4]，原因之一為NSCLC細胞可以通過不同機制逃脫機體的免疫監控，使機體不能產生或不能及時產生抗腫瘤的免疫應答[5]。近年來，腫瘤免疫治療已逐漸成為包括肺癌在內的多種惡性腫瘤的重要治療手段之一[6]，其中免疫檢查點程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)和及其配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)受到了很大的關注[7]。PD-L1與PD-1結合可抑制T淋巴細胞的增殖，參與腫瘤免疫逃逸、促進腫瘤生長與侵襲[8]。因此，PD-1/PD-L1表達水平作為腫瘤監測及免疫治療效果的生物標志物的相關研究備受關注。本研究采用流式細胞學技術檢測NSCLC患者外周血T細胞亞群和單核細胞表面的PD-1和PD-L1表達水平，并探討其臨床意義，為尋找PD-1/PD-L1抑制劑的有效預測生物標志物提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

連續收集2020年1月至2021年2月遂寧市中心醫院呼吸與重癥醫學科二病區收治的符合入排標準的晚期NSCLC患者作為肺癌組。納入標準：1)經病理學和(或)細胞學檢查確診為NSCLC；2)依據國際肺癌TNM分期標準(第7版)分期為ⅢB～Ⅳ期；3)年齡>18歲，首次治療患者；4)患者對研究知情同意。排除標準：1)有腫瘤疾病史或罹患其他惡性腫瘤；2)臨床信息不完整。共納入56例NSCLC患者，其中，男性38例(67.86%)、女性18例(32.14%)；年齡48～79歲，平均年齡(61.86±7.11)歲；ⅢB期10例(17.86%)、Ⅳ期46例(82.14%)；肺腺癌18例(32.14%)、肺鱗癌36例(64.29%)、肺腺鱗癌2例(3.57%)。

按照1∶2的比例選擇科室同期收治的性別(同性別)、年齡(±3歲)相匹配的普通肺部疾病患者為作為對照組，排除肺癌及其他惡性腫瘤疾病史。共納入112例普通肺部疾病患者，男性76例(67.86%)、女性36例(32.14%)；年齡46～77歲，平均年齡(60.12±8.23)歲；疾病類型：慢阻肺48例(42.86%)、支氣管擴張27例(24.11%)、社區獲得性肺炎26例(23.21%)、哮喘11例(9.82%)。兩組患者性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，基線資料具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血PD-1/PD-L1表達水平檢測

1.2.1.1 外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)制備 分別抽取兩組患者新鮮外周血5 mL送至檢驗科備用，在15 mL容量的離心管中加入5 mL外周血淋巴細胞分離液(上海索寶生物科技公司生產)，再將經肝素抗凝的5 mL外周血緩慢加入離心管中，使用低速離心機(美國Thermo公司)在室溫環境下離心20 min，轉速為1 500 r/min，吸出單核細胞層將其移至新的離心管備用，即為PBMC。

1.2.1.2 流式細胞學檢測 取3支流式細胞儀試管分別標記為CD4/PD-1、CD8/PD-1和CD14/PD-L1，加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution, PBS)清洗制備待用的PBMC細胞3次，細胞密度保持在1×106個/mL。在3支試管中分別加入CD4-FITC/PD-1-PE、CD8-FITC/PD-1-PE和CD14-FITC/PD-L1-PE(美國Biolegend公司)，室溫環境下避光反應20 min，加入200 μL紅細胞裂解液(美國Beckman-Couter公司)和2 mL的PBS，轉速1 500 r/min，離心5 min，后棄上清液，加入2 mL的PBS，通過流式細胞儀(美國Beckman-Couter)檢測CD4+T細胞PD-1、CD8+T細胞PD-1和CD14+單核細胞PD-L1的表達率。

1.2.2 療效評價及亞組分析

采用實體腫瘤療效評價(RECIST 1.1)標準對肺癌組中完成2～4個周期化療患者進行療效評價，其中，部分緩解(partial response, PR)：治療后靶病灶的總直徑相比基線水平減少>30%；疾病進展(progressive disease, PD)：治療后靶病灶的總直徑相比總直徑最小測量值增加>20%，且靶病灶的總直徑的絕對值增加>5 mm或出現一個及以上新病灶。比較PR組(n=10)和PD組(n=12)治療前后外周血PD-1和PD-L1表達水平的差異。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0進行統計學分析，對服從正態分布或近似服從正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料采用率/百分比/構成比[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率

NSCLC組患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.05，表1)。

表1 兩組患者外周血CD4+T、CD8+T細胞PD-1表達率及CD14+單核細胞PD-L1表達率

2.2 兩組患者外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率

NSCLC組患者外周血CD14+單核細胞表面PD-L1表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05,表1)。

2.3 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率

組間比較：治療前不同療效兩組患者的外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率之間差異均無統計學意義(均P>0.05)；而治療后PD療效組NSCLC患者的CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率均明顯高于PR療效組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

組內比較：PR療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率均低于治療前基線水平，差異有統計學意義(P<0.05)；PD療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率均明顯高于治療前基線水平，差異有統計學意義(P<0.05,表2)。

表2 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD4+T、CD8+T細胞PD-1表達率

2.4 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率

組間比較：治療前不同療效兩組患者的外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率之間差異無統計學意義(P>0.05)；而治療后PD療效組NSCLC患者的CD14+單核細胞PD-L1表達率明顯高于PR療效組，差異有統計學意義(P<0.05)。

組內比較：PR療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率低于治療前基線水平，差異有統計學意義(P<0.05)；PD療效組中，治療后NSCLC患者的外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率明顯高于治療前基線水平，差異有統計學意義(P<0.05,表3)。

表3 不同療效肺癌患者治療前后外周血CD14+單核細胞PD-L1表達率

3 討 論

目前腫瘤免疫療法是近幾年腫瘤治療領域研究的熱點，其中PD-1/PD-L1檢查點抑制劑被認為是最有前景的治療方式[9]，且在肺癌患者的治療中取得了令人矚目的成效[10]。PD-1在活化T細胞、NK細胞及B細胞中大量表達，而PD-L1則在各種免疫細胞如單核細胞、腫瘤細胞中大量表達。腫瘤細胞可以通過高表達的PD-L1與T細胞表面PD-1結合后，抑制T淋巴細胞免疫功能，誘導腫瘤抗原特異性T細胞程序性死亡，從而實現腫瘤細胞的免疫逃逸[11]。有研究顯示[12]，PD-1/PD-L1抑制劑能顯著延長晚期NSCLC患者的總生存時間和無進展生存時間。美國食藥監局已經批準了帕博利珠單抗、阿替利珠單抗等多種抗PD-1/PD-L1單克隆抗體在晚期NSCLC患者中的應用，FDA還批準了多種商業化的PD-L1檢測試劑盒用于臨床檢測[13]。在中國，PD-1/PD-L1抑制劑及PD-L1檢測試劑盒已逐步上市，并應用于NSCLC的治療和診斷[14]。

本研究中采用流式細胞學檢查方法，檢測外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞表面PD-1分子及CD14+單核細胞表面PD-L1分子的表達率，結果證實晚期NSCLC患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞表面PD-1分子表達百分率相較于呼吸內科收治的肺部普通疾病患者群體明顯升高，同時在晚期NSCLC患者的外周血CD14+單核細胞表面同樣存在PD-L1分子的高表達。據此推測位于CD14+單核細胞表面高表達的PD-L1分子也可以通過與T細胞表面的PD-1分子相互作用，抑制T細胞的活化功能，甚至導致細胞凋亡，進而抑制了CD4+T細胞和CD8+T細胞的免疫功能，最終導致NSCLC腫瘤細胞免疫逃逸的發生[15-16]。

與此同時，本研究還對完成單純采用三代含鉑方案的全身化療治療2～4周期后患者的PD-1/PD-L1表達水平進行隨訪，按照實體腫瘤療效評價(RECIST 1.1)標準，選擇治療后PR和PD患者進行亞組分析，結果發現，臨床療效為PR的NSCLC患者治療后其外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞PD-1表達率及CD14+單核細胞PD-L1表達率均較治療前的基線水平明顯下降；與此相反，PD組患者的PD-1、PD-L1表達水平均較治療前基線水平進一步上升[17]。這與國內學者邢玉斐等[18]報道的晚期NSCLC患者PBMC表面PD-L1分子表達率的強弱決定了PD-L1分子與T細胞相互作用過程中所發揮的抑制T細胞增殖作用具有一致性。

綜上所述，晚期NSCLC患者外周血T細胞和單核細胞存在PD-1和PD-L1表達的異常上調，提示可通過檢測免疫細胞表面PD-1/PD-L1的表達水平來判斷疾病嚴重程度和作為預后的輔助生物學預測指標，但由于本研究樣本量較小、也并未做不同臨床病理特征之間的比較，因此研究結論還需要更多的前瞻性、大樣本研究進一步探討。

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