龍須菜5種生活史階段藻體間內參基因的篩選?

楊 澤，張贏月，楊金鑫，徐 滌

(中國海洋大學海洋生命學院，海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

對具有世代交替生活史的藻類植株不同生活史階段的特異表達基因分析是藻類研究的一個重要領域[1-2]，而實時熒光定量PCR(real-time qPCR)因其靈敏度高、可重復性和動態(tài)范圍大[3]，常用于比較不同樣品或不同組織的基因轉錄水平，以及基因表達的評估[4-6]。但是基因表達分析還依賴于合適的在各樣品中穩(wěn)定表達的內參基因，而人們逐漸認識到沒有一個基因可以作為所有物種的內部控制基因[7-10]。此外，對于某些研究來說，選擇單一的內部控制基因進行標準化并不完全可靠，在某些條件下，用兩種或兩種以上內部控制基因進行標準化所獲得的結果可能有差異甚至是相互矛盾的[8,11-13]。與藻類特定生活史階段相關的基因表達分析還涉及到不同倍性藻體的表達差異等問題，因此要求本文作者對研究的物種進行逐一的分析，研究內參基因在不同生活史階段、不同組織(或細胞)中表達的差異，并確定適當的內參因對于研究特定物種的基因表達至關重要。

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)是一類重要的經濟紅藻，主要作為提取瓊膠的原料[14]，因其蛋白質含量較高，龍須菜也可用于食品、鮑魚飼料等[15]。龍須菜在中國廣泛分布于黃海海域[16]，在山東主要分布在潮間帶[17]，屬于紅藻門(Rhodophyta)、紅藻綱(Rhodophyceae)、江蘺科(Gracilariaceae)、龍須菜屬(Gracilariopsis)。龍須菜的生活史具有世代交替現(xiàn)象，共有3個世代，包括二倍體的四分孢子體世代和果孢子體世代，以及單倍體的配子體世代，其中四分孢子體與配子體的形態(tài)相同，為大型的枝葉狀藻體；而果孢子體囊狀，個體微小，生長在雌配子體枝條上[18]。

以往針對大型紅藻的內參基因篩選，往往要檢測在環(huán)境條件變化下的表達穩(wěn)定性[19]，卻很少針對不同世代藻體本身。然而對藻類發(fā)育和世代交替過程的研究需要探究的不僅僅是環(huán)境條件對其影響，藻體自身的基因調控機制更是相關研究的重點。因此本文研究了9個管家基因(18SrRNA、28SrRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、肌動蛋白基因(ACT)、翻譯延伸因子1(EF1)、別藻藍蛋白基因(APC)、藻紅蛋白基因(PEB)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亞基基因(rbcL)和細胞色素c氧化酶基因(COX))在龍須菜5種枝葉狀生活史階段的藻體中的表達穩(wěn)定性，用于篩選其不同生活史階段中穩(wěn)定表達的內參基因，為今后對龍須菜的繁殖及世代相關基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選取5種實驗材料：樣品1～3分別為自然界采集的野生成熟四分孢子體、雌配子體和雄配子體。成熟的四分孢子體和雌配子體可分別通過藻體表面上的四分孢子囊和囊果來確定，而龍須菜的精子囊平面分布于表皮層，無法從形態(tài)上區(qū)分[16]，只能通過與雌配子體雜交后確認。野生龍須菜于10月份采集自青島浮山灣(36°0′N,120°2′E)，使用滅菌海水對各階段藻體進行刷洗，然后將其放入添加了 f/2 培養(yǎng)基的滅菌海水中，在溫度為23 ℃、光照為25 μmol·m-2·s-1、光周期L/D為12 h/12 h條件下進行暫養(yǎng)，一周后選取狀態(tài)良好的部位迅速于液氮中速凍，隨即暫存于-80 ℃冰箱。樣品4和5分別為實驗室預先培養(yǎng)的幼孢子體和幼配子體，由野生果孢子體和四分孢子體放散的果孢子及四分孢子萌發(fā)后長成的，選取長度約為3～4 cm的小苗，也暫存于-80 ℃冰箱。

1.2 引物設計

本研究選取9個管家基因作為候選內參基因(見表1。其中，GAPDH、APC、rbcL的引物是通過使用Primer Premier 6.0 依據引物設計原則自行設計而得到的，其他6個基因引物是參考文獻[19]而得的。

表1 候選內參基因引物相關信息Table1 Primers related information of candidate internal reference genes

1.3 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

樣品1～5各稱取 0.15 g藻體，使用 RNA 提取試劑盒(TaKaRa)提取總RNA，使用2%瓊脂糖凝膠電泳證實總RNA的完整性，并使用NanoDrop測定RNA濃度。使用反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)對所提RNA進行反轉錄，反應總體系為20 μL，包含10 μL RNA(200 ng/μL)、4 μL 5×PrimerScript RT Master Mix和6 μL RNase Free dH2O。

1.4 標準曲線的繪制

使用各特異性引物，通過聚合酶鏈反應擴增每個管家基因的片段，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA Bio-Tek，Doraville,GA,USA)純化擴增產物，隨后將每個管家基因片段克隆至007載體(TSKINGKE)，使用NanoDrop測定線性質粒的濃度，按照下列公式計算管家基因的初始拷貝數[20]:

Copy number=

使用TB Green?PremixExTaqTMⅡ 試劑盒在定量PCR儀(BIOER LineGene 9640)上進行qRT-PCR，反應體系為20 μL，反應混合物包含：10 μL SYBR Green Master Mix、1 μL 1∶10系列稀釋的線性化質粒模板(共稀釋5級)、1 μL正向引物(10 mmol/L)、1 μL反向引物(10 mmol/L)以及7 μL RNase-free的水。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。繪制擴增產物熔解曲線(65～95 ℃)，獲得Ct值，根據標準品的Ct值與相應基因拷貝數構建標準曲線[21]。

1.5 各樣品的實時熒光定量PCR反應

qRT-PCR反應體系與反應程序同上。所有樣品以總RNA的量進行歸一化，每個樣品設置3個平行樣，擴增效率(E)和線性相關系數(R2)用于評估引物效率：

E(%)=(10[-1/slope]-1)×100，0.98

式中：slope代表標準曲線的斜率；R2越接近1，表示線性關系越顯著，數據越準確。

1.6 結果分析

(1) 通過Ct值與標準曲線的關系[22]，可以得出5種材料的基因拷貝數，通過拷貝數的差異來評價基因的穩(wěn)定性。

(2) 采用geNorm軟件[23]對qRT-PCR的結果進行計算，并得出穩(wěn)定參數M。

(3) 采用NormFinder軟件[24]對qRT-PCR結果進行計算，得出穩(wěn)定值SV，比較候選內參基因的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取和候選內參基因引物特異性分析結果

瓊脂糖凝膠電泳分析結果見圖1，提取的5個樣品的總RNA皆有28S、18S、5S三條帶，表明提取的RNA完整性較高。

對9個候選內參基因的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)，結果表明，每個候選內參基因的PCR擴增產物都為單一條帶，片段大小與預期一致；通過對9個候選內參基因進行qRT-PCR，可以發(fā)現(xiàn)，熔解曲線皆有單一溶解峰，且擴增效率分布在95.18%～101.39%之間，表明候選內參基因的引物特異性符合要求(見表2)。

表2 候選內參基因標準曲線及擴增效率Table 2 Standard curve and amplification efficiency of candidate internal reference genes

2.2 候選內參基因循環(huán)閾值分析結果

通過對龍須菜不同生活史階段候選內參基因循環(huán)閾值(Ct值)分析(見圖3)發(fā)現(xiàn)，9個候選內參基因的Ct平均值范圍為6.18～30.77。其中：18SrRNA的轉錄水平最高，其Ct值為4.14～7.20；rbcL的轉錄水平最低，其Ct值為29.12～33.52。值得注意的是，所有候選內參基因中，GAPDH的Ct值變化范圍最小(17.66～19.57)，相差1.91個循環(huán)；APC的Ct值變化范圍最大(15.31～20.86)，相差5.55個循環(huán)。

2.3 候選內參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 候選內參基因差異倍數分析 先根據標準曲線獲得各樣品中內參基因的拷貝數(見表3)，然后通過比較基因拷貝數兩兩之間的差異對龍須菜不同生活史階段中的這些候選內參基因的穩(wěn)定性進行了多組合分析。在每個分析組中，如果只有2個樣品則直接進行比較；如果分析組中樣品數多于2個則先進行兩兩比較后取平均值。

表3 不同樣本候選內參基因拷貝數Table 3 Copy number of candidate internal reference genes in different samples copy·μg-1

最終的排序列于表4，結果顯示，在全部5個樣品中，28S的差異倍數最小(1.66倍)，其次是PEB(1.81倍)，再次是ACT(2.41倍)；在成熟及未成熟四分孢子體(1和4)的比較中，18SrRNA的差異倍數最小(1.13倍)，其次是28SrRNA(1.24倍)，再次是PEB(1.35倍)；在成熟雌配子體和雄配子體(2 和3)的比較中，EF1的差異倍數最小(1.11倍)；在成熟雌、雄配子體及未成熟配子體(2 、3 和5)的比較中，EF1的差異倍數最小(1.07倍)；在未成熟四分孢子體及配子體(4 和5)的比較中，rbcL的差異倍數最小(1.47倍)，其次是GAPDH(1.65倍)、28SrRNA(2.17倍)；在成熟四分孢子體及雌、雄配子體(1 、2 和3)的比較中，ACT的差異倍數最小(1.45倍)，其次是28SrRNA的差異倍數(1.61倍)，再次是EF1的差異倍數(2.02倍)。

表4 候選內參基因在不同實驗設置下拷貝數差異倍數比較Table 4 Comparison of copy number difference multiples of candidate internal reference genes under different experimental settings

2.3.2 兩種軟件分析全部樣本候選內參基因結果

2.3.2.1 geNorm軟件分析結果 利用Vandesompele等[5]編寫的geNorm軟件，通過Ct值篩選合適的內參基因(見表5)，根據M值對候選內參基因進行排序(M越小，穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差)，同時根據差異性(Varied across，V)確定最適內參基因數目，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內參基因數目為n個，反之則為n+1個。結果表明：在全部樣本中，除PEB(M=1.509)外，其他候選內參基因的穩(wěn)定參數M值均小于臨界值1.5，ACT和GAPDH的M值最小(0.708)，穩(wěn)定性最好；PEB的M值最大(1.509)，穩(wěn)定性最差；在比較配對差異性時發(fā)現(xiàn)，Vn、Vn+1均大于0.15，因此不能靠閾值(0.15)來決定最適內參基因個數，評估目的基因在5種材料之間的表達時，選取2～3個穩(wěn)定性強的內參基因即可。

2.3.2.2 NormFinder軟件分析結果 根據計算出的SV值對候選內參基因進行排序(SV值越小，穩(wěn)定性越高，反之，穩(wěn)定性越低)，結果表明：在龍須菜全部樣本之間的比較中，ACT的SV值最小，穩(wěn)定性最好，其次是GAPDH的SV值，再次是28SrRNA的SV值(見表5)。

表5 候選內參基因表達穩(wěn)定性綜合排名Table 5 Comprehensive ranking of expression stability of candidate internal reference genes

3 討論

為了準確分析不同生活史階段和不同組織中的基因表達，必須篩選出合適的內參基因[25-26]，本實驗基于基因組和轉錄組數據，對9個具有不同功能的候選內參基因，通過拷貝數差異倍數分析法并采用geNorm、NormFinder等分析軟件對熒光定量PCR的數據進行處理，篩選出適合龍須菜不同世代的定量PCR內參基因。此外，有研究者認為應使用兩個或者多個內參基因，以確保實驗的準確性[23,27-28]，因此對于涉及多個生活史階段及倍性差異的龍須菜，必須謹慎篩選合適的內參基因。

在之前的研究中，18SrRNA、GAPDH和ACT基因常被選為高等植物和高等動物的內參基因[11,29-32]。以往在藻類研究中這些內參基因也在不同的條件下被使用，例如在衣藻中發(fā)現(xiàn)GAPDH可用于冷凍馴化時的基因標準化[33]，18SrRNA被選為長石莼不同光強條件下的最佳內參基因[34]。其他內參基因，如EF1基因，已被提議適用于在特定條件下的RT-PCR實驗中的基因標準化[35]。在同樣涉及多個生活史階段的條斑紫菜的研究中，發(fā)現(xiàn)GAPDH適合用作條斑紫菜不同生活史階段基因表達研究的內參基因[36]，這為研究龍須菜不同生活史階段的內參基因篩選提供了基礎。而在龍須菜中，研究多關注在對環(huán)境脅迫的響應上，Ding等[19]篩選出了適合不同溫度的內參基因。然而針對江蘺等物種不同世代中特異表達基因的研究[37-38]需要對內參基因的選擇進行全面檢測評估，以確保實驗結果的準確性。

本研究通過對候選內參基因在不同樣品中的拷貝數及拷貝數差異倍數的分析，發(fā)現(xiàn)二倍體成熟四分孢子體和未成熟四分孢子體(1 vs 4)組內候選內參基因間的拷貝數差異倍數范圍最小(1.13～2.13)；其次是單倍體成熟雌配子體和雄配子體(2 vs 3)組內侯選內參基因間的拷貝數差異倍數范圍(1.11～7.11)；再次是成熟雌、雄配子體和未成熟配子體(2 vs 3 vs 5)組內候選內參基因間的拷貝數差異倍數范圍(1.07～6.66)。更值得注意的是，成熟四分孢子體和成熟雌、雄配子體(1 vs 2 vs 3)組內候選內參基因間的拷貝數差異倍數較大(1.45～9.10)；同時在比較未成熟四分孢子體和配子體(4 vs 5)組內候選內參基因間的拷貝數差異倍數時，發(fā)現(xiàn)其差別最大(1.47～15.87)。因而本文作者認為，這些管家基因在不同倍性的藻體間表達差異最大，其次是雌、雄配子體間的表達差異，而成熟四分孢子體和未成熟四分孢子體之間候選內參基因的差異最小。

此外，本研究還使用了geNorm和Normfinder兩種常用內參基因篩選軟件對全部樣品進行了分析，發(fā)現(xiàn)結果與使用拷貝數的分析結果總體一致，在研究包含二倍體及單倍體等各階段生活史樣品時，28SrRNA、GAPDH和ACT都被認為是合適的內參基因，因此在今后相近物種的內參基因篩選時可以直接使用軟件分析的方法。

因此，本研究作者認為，當僅有二倍體四分孢子體為研究對象時，候選內參基因的穩(wěn)定性總體較好，推薦18SrRNA、28SrRNA為最適內參基因；當僅有單倍體雌、雄配子體作為研究對象時，推薦EF1、28SrRNA為最優(yōu)內參基因；綜合雌配子體和雄配子體及所有混合樣本的分析結果，推薦28SrRNA和ACT為最適內參基因。