LncRNA FGD5-AS1靶向miR-195-5p調(diào)控彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞活性

羅蔓琳 鄭興萍 楊婭娟 張 良（云南省第二人民醫(yī)院輸血科，昆明 650021）

彌漫型大B細胞淋巴瘤是臨床常見的成人非霍奇金淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤發(fā)病率的30%左右，利妥昔單抗標(biāo)準(zhǔn)化治療方案可明顯改善彌漫型大B細胞淋巴瘤患者五年生存率，但仍有部分患者死于耐藥或復(fù)發(fā)。已知長鏈非編碼RNA（LncRNA）在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但作用機制尚未闡明［1-4］。FGD5-AS1在腎細胞癌中表達升高，并可調(diào)控miR-5590-3p及ERK/AKT信號通路從而促進腎細胞癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移［5］。miR-195-5p通過靶向CEP55抑制非小細胞肺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［6］。但FGD5-AS1與miR-195-5p在彌漫型大B細胞淋巴瘤中的表達及其可能作用機制尚未可知。因此，本研究主要探討FGD5-AS1對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖、凋亡的影響，及其對miR-195-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人B淋巴母細胞IM-9、彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-Ly1、OCI-Ly4、OCI-Ly10購自美國ATCC細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；si-NC、si-FGD5-AS1、miR-NC、miR-195-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-195-5p購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT試劑、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人CyclinD1、Cleaved-caspase-3、β-catenin抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 分組IM-9、OCI-Ly1、OCI-Ly4、OCI-Ly10細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，生長至80%匯合時傳代。取對數(shù)生長期OCI-Ly1細胞（2.5×105個/ml）接種于96孔板（100μl/孔），參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-FGD5-AS1、miR-NC、miR-195-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-195-5p、si-FGD5-AS1+anti-miR-NC、si-FGD5-AS1+anti-miR-195-5p，分別記為si-NC組、si-FGD5-AS1組、miR-NC組、miR-195-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-195-5p組、si-FGD5-AS1+anti-miR-NC組、si-FGD5-AS1+antimiR-195-5p組，同時將正常培養(yǎng)的細胞作為NC組。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞FGD5-AS1、miR-195-5p表達 采用Trizol法提取IM-9、OCI-Ly1、OCI-Ly4、OCI-Ly10細胞及各組轉(zhuǎn)染后的OCI-Ly1細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書配制反應(yīng)體系與設(shè)置反應(yīng)條件，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍后進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 1μl、ddH2O補足至20μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀檢測FGD5-AS1、miR-195-5p相對表達。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 取各組OCI-Ly1細胞（2.5×105個/ml）接種于96孔板（100μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，20μl/孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，150μl/孔加入DMSO，室溫避光孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度（A）。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取各組OCI-Ly1細胞，預(yù)冷PBS洗滌，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入5μl AnnexinⅤ-FITC與5μl PI，室 溫 振 蕩 孵 育10 min，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測FGD5-AS1與miR-195-5p的靶向關(guān)系starbase預(yù)測顯示FGD5-AS1與miR-195-5p存在結(jié)合位點，將含有結(jié)合位點的序列載入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體FGD5-AS1-WT，采用基因突變技術(shù)突變結(jié)合位點，將含有突變位點的序列載入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建突變型載體FGD5-AS1-MUT，miR-NC、miR-195-5p mimics分 別 與FGD5-AS1-WT、FGD5-AS1-MUT共轉(zhuǎn)染至OCI-Ly1細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Westernblot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、β-catenin蛋白表達 取各組OCI-Ly1細胞加入400μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，將上樣緩沖液加入蛋白樣品后置于沸水中煮10 min變性蛋白，取40μg蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000）4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液（1∶2 000）室溫條件孵育1 h，滴加ECL，暗室曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系FGD5-AS1和miR-195-5p表達 與IM-9細胞比較，彌漫型大B細胞 淋 巴 瘤 細 胞 系OCI-Ly1、OCI-Ly4、OCI-Ly10中FGD5-AS1表達升高（P＜0.05），miR-195-5p表達降低（P＜0.05），OCI-Ly1細胞變化最為顯著（表1），因此選擇OCI-Ly1細胞進行后續(xù)研究。

表1 彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系FGD5-AS1和miR-195-5p表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of FGD5-AS1 and miR-195-5p in diffuse large B-cell lymphoma cell lines（±s，n=9）

表1 彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系FGD5-AS1和miR-195-5p表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of FGD5-AS1 and miR-195-5p in diffuse large B-cell lymphoma cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with IM-9 cells，1）P＜0.05.

Groups IM-9 OCI-Ly1 OCI-Ly4 OCI-Ly10 F P FGD5-AS1 1.00±0.10 2.26±0.211）2.01±0.171）1.82±0.161）98.682 0.000 miR-195-5p 1.02±0.10 0.32±0.031）0.43±0.041）0.51±0.051）230.560 0.000

2.2 FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響 與si-NC組比較，si-FGD5-AS1組細胞活力降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of down-expression of FGD5-AS1 on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

表2 FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of down-expression of FGD5-AS1 on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups NC si-NC si-FGD5-AS1 F P FGD5-AS1 1.00±0.10 1.03±0.11 0.43±0.041）130.215 0.000 CyclinD1 0.88±0.08 0.85±0.07 0.38±0.031）174.025 0.000 Cleaved-caspase-3 0.31±0.02 0.34±0.03 0.75±0.071）263.177 0.000 A 1.189±0.11 1.127±0.10 0.637±0.061）96.067 0.000 Apoptosis rate（%）6.33±0.61 6.24±0.60 20.35±1.931）399.478 0.000

圖1 FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響Fig.1 Effect of down-expression of FGD5-AS1 on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1

2.3 過表達miR-195-5p對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-195-5p組細胞活力降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），CyclinD1蛋白水平降低（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05，表3、圖2）。

圖2 Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達Fig.2 Western blot to detect CyclinD1，Cleaved-caspase-3 protein expressions

表3 過表達miR-195-5p對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of over-expression of miR-195-5p on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

表3 過表達miR-195-5p對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of over-expression of miR-195-5p on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-195-5p t P 1.00±0.10 1.73±0.151）12.148 0.000 0.85±0.08 0.46±0.041）13.081 0.000 0.32±0.03 0.81±0.081）17.205 0.000 1.154±0.10 0.543±0.051）16.395 0.000 6.21±0.61 17.38±1.671）18.848 0.000 FGD5-AS1 CyclinD1 Cleaved-caspase-3 A Apoptosis rate（%）

2.4 FGD5-AS1靶向調(diào)控miR-195-5p表達starbase預(yù)測顯示FGD5-AS1與miR-195-5p存在結(jié)合位點（圖3）。miR-195-5p過表達可明顯降低野生型載體FGD5-AS1-WT熒光素酶活性（P＜0.05），而對突變型載體FGD5-AS1-MUT熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05，表4）。表明FGD5-AS1可靶向結(jié)合miR-195-5p。與si-NC組比較，si-FGD5-AS1組miR-195-5p表達升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-FGD5-AS1組miR-195-5p表 達 降 低（P＜0.05，表5）。

表4 miR-NC或FGD5-AS1-野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2細胞后雙熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or FGD5-AS1-wild-type and mutant-type reporter plasmids into H9C2 cells（±s，n=9）

表4 miR-NC或FGD5-AS1-野生型及突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2細胞后雙熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or FGD5-AS1-wild-type and mutant-type reporter plasmids into H9C2 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-195-5p t P FGD5-AS1-WT 1.00±0.10 0.45±0.041）15.320 0.000 FGD5-AS1-MUT 1.03±0.11 0.99±0.10 0.807 0.431

表5 qRT-PCR檢測miR-195-5p表達（±s，n=9）Tab.5 qRT-PCR to detect expression of miR-195-5p（±s，n=9）

表5 qRT-PCR檢測miR-195-5p表達（±s，n=9）Tab.5 qRT-PCR to detect expression of miR-195-5p（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with pcDNANC group，2）P＜0.05.

Groups si-NC si-FGD5-AS1 pcDNA-NC pcDNA-FGD5-AS1 F P miR-195-5p 1.00±0.10 2.11±0.201）0.96±0.09 0.47±0.042）289.789 0.000

圖3 Starbase預(yù)測miR-195-5p與FGD5-AS1結(jié)合Fig.3 Starbase prediction of combination of miR-195-5p and FGD5-AS1

2.5 低表達miR-195-5p可逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-195-5p組細胞活力升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），CyclinD1蛋白水平升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05）；與si-FGD5-AS1+anti-miRNC組比較，si-FGD5-AS1+anti-miR-195-5p組細胞活力升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），CyclinD1蛋白水平升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P＜0.05，圖4、表6）。

圖4 Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3表達Fig.4 Western blot to detect expressions of CyclinD1 and Cleaved-caspase-3

表6 低表達miR-195-5p可逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Down-expression of miR-195-5p reversed effect of down-expression of FGD5-AS1 on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

表6 低表達miR-195-5p可逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1低表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1增殖、凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Down-expression of miR-195-5p reversed effect of down-expression of FGD5-AS1 on proliferation and apoptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells OCI-Ly1（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05；compared with si-FGD5-AS1+anti-miR-NC group，2）P＜0.05.

Groups anti-miR-NC anti-miR-195-5p si-FGD5-AS1+anti-miR-NC si-FGD5-AS1+anti-miR-195-5p FP miR-195-5p 1.00±0.11 0.36±0.031）2.03±0.18 1.17±0.112）296.557 0.000 CyclinD1 0.83±0.08 1.28±0.121）0.40±0.04 0.88±0.082）161.948 0.000 Cleaved-caspase-3 0.31±0.03 0.04±0.011）0.73±0.07 0.34±0.032）427.235 0.000 A 1.148±0.11 1.486±0.141）0.641±0.05 1.024±0.102）99.151 0.000 Apoptosis rate（%）6.30±0.62 2.11±0.201）19.83±1.87 8.02±0.752）462.985 0.000

2.6 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達 與si-NC組比較，si-FGD5-AS1組β-catenin蛋白水平降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-195-5p組β-catenin蛋白水平升高（P＜0.05）；與si-FGD5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-FGD5-AS1+anti-miR-195-5p組β-catenin蛋白水平升高（P＜0.05，圖5、表7）。

圖5 Western blot檢測β-catenin蛋白表達Fig.5 Western blot to detectβ-catenin protein expression

表7 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression（±s，n=9）

表7 Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with anti-miRNC group，2）P＜0.05；compared with si-FGD5-AS1+anti-miRNC group，3）P＜0.05.

Groups si-NC si-FGD5-AS1 anti-miR-NC anti-miR-195-5p si-FGD5-AS1+anti-miR-NC si-FGD5-AS1+anti-miR-195-5p F P β-catenin 0.73±0.07 0.28±0.021）0.75±0.08 1.27±0.122）0.30±0.032）0.75±0.073）107.707 0.000

3 討論

FGD5-AS1通過充當(dāng)miR-302e的競爭性內(nèi)源RNA分子而上調(diào)CDCA7表達，從而促進結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［7］。FGD5-AS1通過競爭性結(jié)合miR-153-3p調(diào)節(jié)MCL1表達而促進口腔癌進展［8］。FGD5-AS1通過miR-153-3p/CITED2軸調(diào)節(jié)胃癌細胞增殖［9］。本研究顯示，彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞FGD5-AS1表達升高，提示FGD5-AS1在彌漫型大B細胞淋巴瘤發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因作用，原因可能為FGD5-AS1在不同腫瘤組織中表達不同。CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，可正向調(diào)控細胞周期，促進細胞增殖［10］。本研究顯示，干擾FGD5-AS1表達可明顯降低彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞活力，抑制CyclinD1表達，提示干擾FGD5-AS1表達可抑制彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖。線粒體途徑是細胞凋亡主要途徑之一，當(dāng)細胞接收凋亡信號時，線粒體釋放細胞色素C，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)從而促進細胞凋亡［11］。本研究顯示，干擾FGD5-AS1表達可明顯提高彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞凋亡率，促進Cleaved-caspase-3表達，提示干擾FGD5-AS1表達可促進彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞凋亡。

本研究證實FGD5-AS1能夠競爭性結(jié)合miR-195-5p，并負向調(diào)控miR-195-5p表達。miR-195-5p通過抑制ARL2表達抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲［12］。miR-195-5p通過靶向YAP1抑制宮頸癌惡性進展［13］。miR-195-5p通過FOXK1抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲［14］。本研究顯示，彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞miR-195-5p表達降低，進一步研究顯示，miR-195-5p過表達可明顯降低彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞活力，提高細胞凋亡率，而抑制miR-195-5p表達可明顯增強彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞活力，降低凋亡率，促進CyclinD1表達而抑制Cleaved-caspase-3表達，提示miR-195-5p過表達可抑制彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖及促進細胞凋亡，同時，干擾FGD5-AS1表達與抑制miR-195-5p表達聯(lián)合處理可明顯提高彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞活力，降低細胞凋亡率，提示抑制miR-195-5p表達可明顯逆轉(zhuǎn)干擾FGD5-AS1表達對彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖及凋亡的作用。Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可調(diào)控細胞增殖、黏附等生物學(xué)過程，在腫瘤形成過程中異常活化，GSK3β磷酸化可減少胞漿內(nèi)β-catenin降解，導(dǎo)致細胞內(nèi)β-catenin聚集，細胞核內(nèi)β-catenin含量增加，最終促進CyclinD1、MMP-7等下游基因表達［15-16］。本研究顯示，干擾FGD5-AS1表達后β-catenin蛋白水平降低，抑制miR-195-5p表達后β-catenin蛋白水平升高，而干擾FGD5-AS1與抑制miR-195-5p表達聯(lián)合處理后β-catenin蛋白水平升高，提示FGD5-AS1/miR-195-5p調(diào)控彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖及凋亡的生物學(xué)過程與Wnt/β-catenin信號通路活化密切相關(guān)。

綜上，彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞FGD5-AS1表達升高，而miR-195-5p表達降低，干擾FGD5-AS1表達可通過負調(diào)控miR-195-5p表達抑制彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞增殖及促進細胞凋亡，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路活化有關(guān)，為彌漫型大B細胞淋巴瘤治療提供了潛在靶標(biāo)。本研究僅采用彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞OCI-Ly1進行研究，彌漫型大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-Ly4、OCILy10中FGD5-AS1/miR-195-5p是否可發(fā)揮相似作用及可能作用機制仍需進一步探究。