抵抗素對雄性小鼠生殖功能的影響

劉小平， 張 庚， 劉 丹， 朱曉歡， 魯兆軒，位 蘭， 文鳳云，2

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽市優(yōu)質(zhì)畜禽種質(zhì)資源與遺傳繁育重點實驗室，河南 洛陽 471023)

0 引言

抵抗素是由白色脂肪細(xì)胞特異分泌的一種肽類激素，是具有激素樣活性的抵抗素樣分子的創(chuàng)始成員，在肥胖和代謝綜合征等生理病理中起主要作用[1]。在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)，將抵抗素敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠肝脂肪變性，血清膽固醇和極低密度脂蛋白水平降低[2]。抵抗素與心血管疾病、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腎臟病和高血壓相關(guān)[3-5]。文獻[6]研究表明：雄性小鼠肥胖組、動脈粥樣硬化組抵抗素表達(dá)與血脂譜及炎癥狀態(tài)顯著相關(guān)。其次，在肥胖個體的血清中觀察到抵抗素水平升高[7-8]，大量證據(jù)表明：抵抗素水平升高與肥胖相關(guān)的惡性腫瘤之間也存在聯(lián)系[9-10]。同時，抵抗素具有強有力的促炎特性，并直接或間接促進癌癥進展[11-15]，血清抵抗素與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌癥等都有關(guān)[16]。

有研究表明：抵抗素存在于不同物種兩性的各個生殖組織中，可能與肥胖相關(guān)的不孕癥等相關(guān)[17]。同時，抵抗素在調(diào)節(jié)體重、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官中也發(fā)揮著重要作用，它通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與青春期的復(fù)雜過程并維持正常的生殖功能。大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抵抗素的基因表達(dá)高于生精小管內(nèi)的支持細(xì)胞，這種表達(dá)受促性腺激素、瘦素和營養(yǎng)狀況的調(diào)節(jié)[18]。人類精液中的抵抗素水平高于血清，并且精液抵抗素與精子質(zhì)量相關(guān)[19]。當(dāng)研究不育患者體內(nèi)抵抗素水平與脂質(zhì)過氧化、過氧化氫酶活性之間潛在關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)患者抵抗素水平與脂質(zhì)過氧化、過氧化氫酶活性、精子凋亡和壞死呈正相關(guān)[20]。體外研究發(fā)現(xiàn)：抵抗素參與精子獲能、精子和卵子融合以及受精[21]。

近年來，對人進行的抵抗素和肥胖相關(guān)的研究已經(jīng)表明：與正常對照組相比，肥胖個體的抵抗素水平較高[7-8，22]，并且與體質(zhì)量指數(shù)和內(nèi)臟脂肪含量呈正相關(guān)[23-24]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素循環(huán)水平在體質(zhì)量下降時顯著降低[25]。體質(zhì)量超重也可能導(dǎo)致精子參數(shù)發(fā)生變化，其精子數(shù)量、流動性和活力不足可能導(dǎo)致生育率下降[26]，但這種體質(zhì)量超重所造成的生育率下降是否與肥胖狀態(tài)下高循環(huán)抵抗素水平相關(guān)目前還不清楚。本研究利用抵抗素重組蛋白，對雄性小鼠進行尾靜脈注射模擬高循環(huán)水平抵抗素，通過小鼠血清生殖激素水平變化測定、精子活動能力檢查、睪丸組織結(jié)構(gòu)檢測以及形態(tài)觀察，以期闡明肥胖狀態(tài)下抵抗素與雄性小鼠生殖功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康雄性8周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF) C57BL/6J小鼠(10只)，體質(zhì)量(20.0 ± 0.6) g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及處理

將試驗小鼠隨機分為試驗組和對照組(n=5)，單籠單只飼養(yǎng)，隨機采食和飲水，自然光照。每日定時稱取體質(zhì)量后進行尾靜脈注射，試驗組小鼠注射終濃度為400 ng/(d·只)的抵抗素溶液(PeproTehc，美國)[27], 對照組小鼠注射等體積雙蒸水，連續(xù)注射6 d，注射完成當(dāng)天斷食斷水12 h，第7天摘除眼球收集血清，同時測量血糖，然后脫頸處死進行樣品采集。

1.2.2 精子的采集與處理

將處死的小鼠仰臥，用乙醇棉球消毒其腹部被毛及皮膚，確定開口位置，然后剪開小鼠腹部，進行睪丸附睪的處理，將一側(cè)睪丸和附睪以及輸精管用眼科剪分離，將睪丸橫切為若干段或組織塊，放入加有1 mL的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖磷酸緩沖鹽溶液的表面皿中，用眼科剪輕輕擠壓睪丸組織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)20 min，使精子自行散開。

1.2.3 小鼠血清生殖激素測定

通過摘眼球取血法采集血液于Eppendorf(EP)管內(nèi)，靜置后于離心機3 000～4 000 r/min離心10 min，取上層血清，在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 精子活力檢查

用滴管吸取精液，將其滴入血球計數(shù)板與蓋玻片接觸處的計數(shù)室，使精液能夠自然流入計數(shù)室中。進行計數(shù)，計數(shù)時選取中間5個中方格(即對角的5個方格或者四角及中間這5個方格)內(nèi)80個小方格的精子數(shù)記為C。先計數(shù)死精子的數(shù)量，將其記為A，將計數(shù)板于50 ℃水浴鍋放置10 min以便殺死精子，第2次計數(shù)精子總數(shù)為B，(B-A)/C為精子活力。計數(shù)時每只小鼠的精子用3個計數(shù)板重復(fù)計數(shù)3次，取其平均值。

1.2.5 精子形態(tài)觀察

取適量精液滴在載玻片上，制成精子懸液涂片。用0.5%(體積分?jǐn)?shù))龍膽紫乙醇溶液染色3 min，自然干燥、水洗，在顯微鏡下觀察精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 睪丸組織結(jié)構(gòu)檢測

處死小鼠并分離睪丸，快速放入戊二醛固定液或電鏡固定液中，分別使用H & E染色和透射電鏡技術(shù)觀察組織結(jié)構(gòu)的變化并拍照保存。

1.3 統(tǒng)計方法

本試驗所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，采用單因素方差的分析方法分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用Dunnet’t法，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響

抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響如表1所示。由表1可知：試驗組小鼠血清內(nèi)雌二醇(estradiol，E2)質(zhì)量濃度和睪酮(testosterone，T)質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的(P<0.05)；試驗組小鼠血清促卵泡成熟素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的質(zhì)量濃度有所降低，但差異不顯著(P>0.05)；試驗組小鼠血清促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的質(zhì)量濃度與對照組相比，有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 抵抗素對小鼠血清生殖激素質(zhì)量濃度的影響

2.2 抵抗素對小鼠精子質(zhì)量的影響

抵抗作用后小鼠精子活力及畸形率的檢測結(jié)果分別如表2和表3所示。表2表明：與對照組相比，試驗組小鼠的精子活力顯著下降(P<0.05)。表3表明：與對照組相比，試驗組小鼠精子畸形數(shù)量更多，畸形率略有升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 抵抗素作用后小鼠精子活力的比較

表3 抵抗素作用后小鼠精子畸形率的比較

2.3 抵抗素對小鼠精子形態(tài)的影響

圖1顯示對照組與試驗組小鼠龍膽紫染色精子的正常形態(tài)及畸形精子的形態(tài)。正常精子的形態(tài)像蝌蚪一樣，頭部呈橢圓形，頸部與尾部相連接，由一條軸絲相連，尾部有鞭毛狀形態(tài)(見圖1a)；畸形精子出現(xiàn)頭部膨大、瘦小、缺損、輪廓不明顯，頸部膨大、不全分叉，尾部曲折、卷曲、斷裂短小等現(xiàn)象。與對照組相比，試驗組小鼠出現(xiàn)畸形精子數(shù)目顯著增加(見圖1b)。

(a) 對照組

2.4 抵抗素對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

在對小鼠睪丸組織樣本進行H & E染色后，在光鏡下以不同放大倍數(shù)觀察對照組小鼠睪丸組織樣本(見圖2和圖3)，發(fā)現(xiàn)：對照組小鼠曲精小管直徑較大，管腔相對較小，含有大量排列規(guī)則的生精細(xì)胞，層次較分明，由基膜向內(nèi)依次是精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，精原細(xì)胞與基膜最接近，精子主要聚集在曲精小管的管腔中央，且精子數(shù)目較多。除此之外，還能看到底部附著于基膜的支持細(xì)胞，其細(xì)胞核形狀不一(見圖2a和3a中箭頭所指)。試驗組小鼠曲精小管直徑小于對照組，但統(tǒng)計學(xué)分析顯示差異不顯著(P>0.05)，管腔相對較大，含有的生精細(xì)胞數(shù)目、層數(shù)相對較少，排列不規(guī)則，或出現(xiàn)排列斷裂等現(xiàn)象。在對照組與試驗組小鼠的睪丸組織樣本中均未觀察到明顯的次級精母細(xì)胞，除此之外，試驗組與對照組的基膜沒有觀察到明顯的差異對比(見圖2b和圖3b中箭頭所指)。

(a) 對照組(b) 試驗組

(a) 對照組(b) 試驗組

2.5 抵抗素處理后小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)變化

抵抗素處理后小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)變化如圖4所示。對照組小鼠的睪丸組織樣本中能夠看到形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、與基膜連接緊密的支持細(xì)胞，核仁清晰可見，形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚，染色質(zhì)集中分布，相鄰支持細(xì)胞之間相互連接，精原細(xì)胞核膜光滑，未出現(xiàn)明顯的凹陷或變形，可以明顯觀察到核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)，視野中有數(shù)目豐富、結(jié)構(gòu)正常的線粒體，多于試驗組，且能觀察到清晰的線粒體脊(見圖4a)。試驗組小鼠的核膜出現(xiàn)了不同程度的凹陷、變形，胞質(zhì)出現(xiàn)部分空泡狀結(jié)構(gòu)，核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)部分缺損，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目較多，線粒體數(shù)目較少，且線粒體出現(xiàn)了一定程度的變形，線粒體嵴發(fā)生溶解，很難觀察到結(jié)構(gòu)清晰的線粒體嵴，高爾基體清晰可見，但支持細(xì)胞與對照組相比沒有觀察到明顯的結(jié)構(gòu)變化，無顯著差異(見圖4b中箭頭所指)。

(a) 對照組

3 討論

抵抗素是在多種激素及營養(yǎng)調(diào)控下脂肪細(xì)胞分泌的一種肽類激素。文獻[28]發(fā)現(xiàn)：抵抗素信使核糖核酸的表達(dá)受年齡的影響，出生45 d的小鼠激素水平最高，此后下降；雄性大鼠的抵抗素信使核糖核酸比雌性大鼠的高，對切除不同年齡大鼠的卵巢和睪丸試驗研究發(fā)現(xiàn)，性激素增加雄性大鼠脂肪組織中抵抗素信使核糖核酸的表達(dá)。這表明抵抗素可以解釋青春期胰島素敏感性下降，可能是由于性類固醇與胰島素敏感性之間的聯(lián)系[29]。也有研究表明： 血清抵抗素水平與促甲狀腺激素呈負(fù)相關(guān), 與游離T3 (FT3) 、FT4水平呈正相關(guān)[30-31]。本試驗將抵抗素重組蛋白通過尾靜脈注射處理小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠的血清E2質(zhì)量濃度和T質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的(P<0.05)，試驗組小鼠血清FSH質(zhì)量濃度和LH質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)，這與文獻[28]的研究結(jié)果一致。

在肥胖小鼠體內(nèi)，血清抵抗素水平顯著上升，且血清抵抗素水平與機體胰島素抵抗程度呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)：高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖能夠?qū)е翭0代和F1代小鼠精子形態(tài)畸形率顯著增加，小鼠精液參數(shù)異常，精子活力和密度降低，精子質(zhì)量下降，同時小鼠睪丸和精子超微結(jié)構(gòu)異常，造成雄性小鼠遺傳性的生殖功能的下降[32]。本試驗中試驗組雄性小鼠的精子活力顯著下降，小鼠精子畸形數(shù)量更多，畸形率相對略有升高，同時小鼠精子形態(tài)異常。睪丸組織樣本中試驗組小鼠曲精小管直徑小于對照組，管腔相對較大，含有的生精細(xì)胞數(shù)目、層數(shù)相對較少，排列不規(guī)則。試驗組小鼠睪丸出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)病變，與對照組相比出現(xiàn)了不同程度的凹陷、變形，胞質(zhì)出現(xiàn)部分空泡狀結(jié)構(gòu)，核膜的雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)部分缺損，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目較多，線粒體數(shù)目較少，且線粒體出現(xiàn)了一定程度的變形。結(jié)果表明：抵抗素對小鼠睪丸和精子的超微結(jié)構(gòu)以及精子相關(guān)參數(shù)產(chǎn)生了顯著影響。

4 結(jié)束語

本研究利用抵抗素重組蛋白進行雄性小鼠尾靜脈注射，模擬高循環(huán)水平抵抗素狀態(tài)，觀察其對雄性小鼠生殖功能的影響，結(jié)果表明試驗組小鼠血清E2質(zhì)量濃度和T質(zhì)量濃度均顯著高于對照組小鼠的，且精子活力顯著下降，精子形態(tài)異常，睪丸出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)變化，提示抵抗素能夠引起雄性小鼠血清生殖激素水平的變化，導(dǎo)致雄性小鼠生殖功能下降。