石斛多糖延緩秀麗隱桿線蟲衰老的研究

李海春 廖思藝 田貴豐 許吉安 劉 偉 黃九九*

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2廣州市博藤貿(mào)易有限公司，廣東廣州 510000；3廣州蜜妝生物科技有限公司，廣東廣州 510000）

石斛屬（Dendrobium）植物為蘭科（Orchidaceae）附生珍稀瀕危物種，為中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。石斛莖中含有豐富的植物多糖，具有滋養(yǎng)皮膚、降低血糖、抗腫瘤、提高免疫力及延緩衰老等功效，素有“藥中黃金”之美稱[2]。對(duì)于石斛多糖滋養(yǎng)皮膚、降低血糖、抗腫瘤、提高免疫力等功能的研究多有報(bào)道[2-5]，但其延緩衰老功能及可能的作用機(jī)理尚缺乏試驗(yàn)依據(jù)。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種無(wú)毒無(wú)害、可以獨(dú)立生存的線蟲，其遺傳背景清楚、個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、基因組測(cè)序完成、進(jìn)化過(guò)程中高度保守、與人類的基因同源性高達(dá)60%～80%，且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易于操作，為國(guó)際上公認(rèn)的分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的首選模式生物，目前被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域[6-8]。

本文選取多糖含量豐富的鐵皮石斛、鼓槌石斛、細(xì)莖石斛為研究對(duì)象，對(duì)石斛多糖影響秀麗隱桿線蟲的壽命、產(chǎn)卵量、運(yùn)動(dòng)行為和熱應(yīng)激能力等進(jìn)行了研究，旨在探討石斛多糖延緩衰老的作用機(jī)理，以期為更好地開發(fā)利用石斛多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、細(xì)莖石斛（Dendrobium moniliforme （L.） Sw.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl.），取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物種質(zhì)保護(hù)與利用研究中心的溫室大棚。

雌雄同體的N2野生型秀麗隱桿線蟲、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌菌株E.coli OP50，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、鼓槌石斛3個(gè)石斛品種，分別從中提取石斛多糖[9]。每個(gè)石斛品種均配置成濃度為0.4、0.8、1.6 mg/mL的石斛多糖溶液，分別取 5 μL，并加入 E.coli OP50 菌液 95 μL，混勻后涂于NGM平板上。得到石斛多糖最終濃度分別為20、40、80 mg/L，對(duì)照組添加相應(yīng)量的無(wú)菌水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 E.coli OP50培養(yǎng)。挑取E.coli OP50單菌落至10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。

1.3.2 秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇和培養(yǎng)。取秀麗隱桿線蟲凍存管于37℃水浴解凍，以1500r/min離心1min，棄上清液，沉淀轉(zhuǎn)移到涂布E.coli OP50的線蟲培養(yǎng)基（NGM）的菌苔外緣，于20℃培養(yǎng)。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲的同期化處理。將處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的線蟲用無(wú)菌M9溶液沖洗轉(zhuǎn)移至EP管，加入等量高氯酸鈉裂解液充分混勻后離心，沉淀用M9溶液清洗2～3次至pH值7.0，取蟲卵滴于含E.coli OP50的NGM平板上20℃恒溫培養(yǎng)，約48 h后，線蟲的受精卵發(fā)育至L4期，完成同期化處理。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 壽命測(cè)定。取同期化的線蟲，記為本次試驗(yàn)的第0天，20℃恒溫培養(yǎng)，每天將存活的線蟲轉(zhuǎn)移到新NGM培養(yǎng)板，記錄線蟲的死亡數(shù)量和存活數(shù)量，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。線蟲無(wú)移動(dòng)、吞咽動(dòng)作且用鉑絲輕觸蟲體無(wú)任何反應(yīng)視為死亡，最后一條線蟲死亡的時(shí)間為該組線蟲的最長(zhǎng)壽命[10]。

1.4.2 產(chǎn)卵量測(cè)定。取同期化的線蟲，每個(gè)NGM平板放置1條，每隔24 h轉(zhuǎn)移到新NGM培養(yǎng)板，待線蟲不再產(chǎn)卵后將所有NGM平板繼續(xù)于20℃恒溫培養(yǎng)。子代線蟲孵化長(zhǎng)大后進(jìn)入產(chǎn)卵期之前對(duì)線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為該線蟲的產(chǎn)卵量[11]，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。

1.4.3 頭部擺動(dòng)頻率測(cè)定。挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)耐诨€蟲，放置在無(wú)大腸桿菌的NGM平板上，記錄1 min內(nèi)線蟲頭部擺動(dòng)的次數(shù)，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。一次頭部擺動(dòng)是指線蟲的頭部從一個(gè)方向擺向另一個(gè)方向后又?jǐn)[回來(lái)[12]。

1.4.4 身體彎曲頻率測(cè)定。挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)耐诨€蟲，放置在無(wú)大腸桿菌的NGM平板上，記錄1 min內(nèi)線蟲身體彎曲的次數(shù)，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。一次身體彎曲是指線蟲向身體所在直線的方向做一個(gè)波長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)[12]。

1.4.5 熱應(yīng)激能力測(cè)定。取同期化的線蟲，于20℃恒溫培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)移到37℃下培養(yǎng)，每隔1 h記錄線蟲的存活率，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)同壽命測(cè)試[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

衰老研究主要關(guān)注的指標(biāo)之一是生物體的壽命長(zhǎng)短[14]。鐵皮石斛、細(xì)莖石斛和鼓槌石斛在石斛屬中均屬于多糖含量較高的種類，試驗(yàn)分別選取不同濃度的石斛多糖添加涂布于NGM平板，觀測(cè)NGM平板秀麗隱桿線蟲的壽命，結(jié)果如表1所示。不同濃度的石斛多糖能顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的最長(zhǎng)壽命和平均壽命；且隨著濃度的增大，石斛多糖延長(zhǎng)壽命的效果越明顯，濃度為80 mg/L的細(xì)莖石斛多糖延長(zhǎng)壽命的效果最好，與不添加多糖的對(duì)照組相比，平均壽命增加了33.3%。

在評(píng)估藥物抗衰老功能特性時(shí)，不僅需要考慮藥物對(duì)生物體壽命的影響，還需要關(guān)注藥物在延長(zhǎng)壽命的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常生理活動(dòng)是否有影響[15]。由表2可知，添加不同濃度的鐵皮石斛多糖、細(xì)莖石斛多糖和鼓槌石斛多糖，秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量與對(duì)照組沒有明顯差異，表明石斛多糖在延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲壽命的同時(shí)并沒有降低其生殖能力。

2.2 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力的影響

運(yùn)動(dòng)是生命的基本存在形式，反映了神經(jīng)系統(tǒng)基本功能完好，生物體衰老往往伴隨著運(yùn)動(dòng)行為能力的下降[16]。對(duì)于線蟲，運(yùn)動(dòng)行為能力的喪失意味著死亡。由表3、表4可知，與不添加石斛多糖的對(duì)照組相比，3種石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率均有明顯提升，且隨著濃度的增大，石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力的影響越明顯；在濃度80 mg/L時(shí)，3種石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)頻率的提升效果相當(dāng)，而鼓槌石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的提升效果最明顯。

表3 不同石斛多糖處理下秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率

表4 不同石斛多糖處理下秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率

2.3 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激能力的影響

細(xì)胞應(yīng)激是由熱、冷、缺氧、酸度變化、炎癥、X射線或紫外線照射等引起的，其中急性熱應(yīng)激通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性影響DNA復(fù)制，從而引發(fā)正常細(xì)胞衰老凋亡，縮短生物體的壽命[17]。生物體對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力被稱作對(duì)環(huán)境的應(yīng)激能力[17]。由圖1可知，在37℃條件下，石斛多糖處理的秀麗隱桿線蟲存活率較對(duì)照得到了明顯提高，并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。其中，80 mg/L細(xì)莖石斛多糖的效果最為明顯，且與其延長(zhǎng)壽命效果相吻合。表明石斛多糖能夠有效提高秀麗隱桿線蟲的熱應(yīng)激能力，其效果與延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命密切相關(guān)。

3 討論

衰老是生物體隨著年齡增長(zhǎng)在功能、形態(tài)等方面出現(xiàn)不可逆的漸進(jìn)性退化，是生物體內(nèi)自發(fā)的必然過(guò)程[18]。它與老年病的發(fā)生密切相關(guān)。延緩衰老可減少動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等老年病的發(fā)生[19]。一些名貴中藥材，例如人參[20]、靈芝[21]、石斛[2]等，都具有一定的延緩衰老作用，但對(duì)其效價(jià)成分和作用機(jī)制尚不清楚，限制了這些藥材的開發(fā)利用。

鐵皮石斛、細(xì)莖石斛和鼓槌石斛含有豐富的植物多糖且表現(xiàn)出良好的離體抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，從這3種石斛中提取得到的粗多糖均能在不影響秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的前提下延長(zhǎng)其平均壽命和最長(zhǎng)壽命。

石斛多糖一般由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等單糖組成2～5個(gè)多糖亞組分復(fù)合而成，用含有石斛多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，線蟲的頭部擺動(dòng)頻率、身體彎曲頻率以及熱應(yīng)激條件下的存活率均隨著多糖濃度的升高而明顯增加，與延長(zhǎng)線蟲的壽命有著密切的正相關(guān)關(guān)系，因而提高線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力和熱應(yīng)激能力可能是延緩其衰老的重要作用機(jī)理。但是，關(guān)于生物體衰老目前有自由基學(xué)說(shuō)、DNA損傷修復(fù)學(xué)說(shuō)、端粒和端粒酶學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)等多種理論[22-23]，其各自的調(diào)控機(jī)制也錯(cuò)綜復(fù)雜，因而石斛多糖延緩衰老的作用機(jī)制仍有待繼續(xù)深入研究。