人參皂甙Rg3對膿毒癥小鼠炎癥反應及淋巴細胞內Cleaved Caspase-3蛋白的影響

李青青 賈雅楠 丁懌虹 陸剛 唐建國 張學敏

膿毒癥是宿主對感染的一種失控反應，常常導致嚴重的多器官功能障礙。膿毒癥是急診、ICU、老年科等科室急重癥患者主要死亡原因之一。膿毒癥治療現在多以抗生素為基礎，同時治療原發疾病，治療周期長、費用高，給患者造成很大的經濟負擔。膿毒癥患者晚期常存在免疫抑制或免疫麻痹，針對膿毒癥的免疫應答機制研究及免疫反應調控的藥物探尋具有重要意義[1]。免疫功能監測指導下的免疫調節治療可能為改善膿毒癥預后開辟一種新的途徑。

人參為五加科多年生草本植物，人參皂甙Rg3是人參的有效成分，是從人參中提取的四環三萜類人參二型皂甙單體。人參皂甙Rg3本身是免疫增強劑，能增強人體對炎癥的抵抗作用[2]。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激模擬膿毒癥狀態小鼠，觀察人參皂甙Rg3對膿毒癥狀態小鼠炎性因子水平、脾臟指數及淋巴細胞內裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Cleaved Caspase-3）蛋白表達的影響，來探討人參皂甙Rg3對膿毒癥小鼠炎癥反應的保護作用及淋巴細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠TNF-α試劑盒（批號：TNDE1021am）、IL-6試劑盒（批號：16NV1021m）、IL-1β ELISA試劑盒（批號：I1FE1021bm）均購自加拿大ANOGEN公司；LPS購自上海環碩生物科技有限公司；人參皂甙Rg3購自成都曼思特生物科技有限公司；Cleaved Caspase-3兔單克隆抗體（批號：3）購自美國Cell Signaling公司。酶標儀（型號：318C+）購自上海市沛歐分析儀器有限公司；電熱恒溫水槽（DK-420）購自上海精宏實驗設備有限公司電泳儀；轉膜儀（型號：DYCZ-40D）購自北京市六一儀器廠；熒光及化學發光成像系統（型號：ChemiScope 6100）購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠40只，6～8周齡，體重18～23 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（滬）2014-0008。所有小鼠飼養在溫度和濕度受控的動物房中，具有12 h/12 h的光/暗循環，小鼠自由進食與飲水。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準，經復旦大學實驗動物科學部動物福利和倫理小組批準。

1.3 分組及模型制備 采用區組隨機法將小鼠分為對照組、人參皂甙Rg3組、LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組，每組10只。其中LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠通過腹腔注射LPS的方法制備膿毒癥模型。對照組用0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液；人參皂甙Rg3組將人參皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液后，灌胃，1次/d，連續7 d，第4天腹腔注射0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液；LPS組用0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液）；人參皂甙Rg3+LPS組將人參皂甙Rg3按30 mg/kg溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液后，灌胃，1次/d，連續7 d，第4天腹腔注射0.3 ml LPS溶液（15 mg/kg LPS溶于0.3 ml 0.9%氯化鈉注射液）。

1.4 檢測指標及方法 第7天所有小鼠用0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，剪開腹腔，通過腹主動脈采血，取血置于塑料離心管中，室溫離心分離出血清（3 000 r/min，10 min），取上層血清-70℃保存，用于測定炎性因子水平；然后采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟，計算脾臟指數；將脾臟剪成小塊，研磨過200目篩網，收集細胞懸液，采用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞置入凍存管-70℃保存，用于檢測蛋白表達。

1.4.1 血清炎性因子水平測定 取出血清后4℃復融，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.4.2 脾臟指數檢測 將小鼠的脾臟結締組織剪除，用濾紙吸凈表面的血液，用分析天平稱重，按以下公式計算出脾臟指數：脾臟指數=脾重量（mg）/體重（g）×10。

1.4.3 Cleaved Caspase-3蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取出淋巴細胞，解凍后用裂解液裂解，提取組織蛋白，應用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行蛋白質分離，上樣后在12%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，以電轉膜方法將蛋白質轉移至醋酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入相關一抗孵育，4℃振蕩過夜，次日5%磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜，加入對應二抗孵育，振蕩1 h，5%PBST洗膜，置于顯影儀中曝光顯影。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，用凝膠分析軟件Quantity One分析Cleaved Caspase-3蛋白條帶灰度值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠血清炎性因子水平比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低（均P＜0.05），見表1。

表1 4組小鼠血清炎性因子水平比較（pg/ml）

2.2 4組小鼠脾臟指數比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠脾臟指數均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠脾臟指數均降低（均P＜0.05），見表2。

表2 4組小鼠脾臟指數比較

2.3 4組小鼠脾臟淋巴細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較 與對照組比較，LPS組、人參皂甙Rg3+LPS組小鼠Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；與LPS組比較，人參皂甙Rg3組、人參皂甙Rg3+LPS組Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），見圖1、表3。

表3 4組小鼠淋巴細胞內Cleaved Caspase-3/β-actin蛋白灰度值比較

3 討論

膿毒癥的發病過程涉及到復雜的全身炎癥反應、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷等多個方面，它可以由任何部位的感染引起。膿毒癥常常發生在原有慢性疾病或年老體衰、外科手術后等患者。LPS刺激是制作動物膿毒癥模型的一種常用方法，本研究采用LPS腹腔注射模擬膿毒癥狀態小鼠，小鼠均在刺激后逐漸出現豎毛、萎靡、腹瀉、飲食及活動次數減少，幾天后癥狀才逐漸緩解好轉。

機體發生膿毒癥時感染因素可激活機體單核巨噬細胞系統及其他炎癥反應細胞，產生并釋放大量炎性因子，膿毒癥期間TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平均會升高[3-5]，它們的協同作用被喻為是細胞因子誘發病理生理級聯反應的扳機，抑制膿毒癥的炎癥，可以降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平[6]，通過檢測這些炎性因子的動態變化可以在一定程度上反映體內炎癥的嚴重程度。本實驗中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾臟指數均高于對照組，而給予人參皂苷Rg3灌胃處理后小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平和脾臟指數均低于LPS組，提示人參皂甙Rg3能減少膿毒癥小鼠炎性因子分泌，降低炎癥反應。

淋巴細胞凋亡是膿毒癥患者免疫抑制的主要原因，膿毒癥時機體大量淋巴細胞會發生凋亡，膿毒癥誘導的免疫抑制的主要特征包括T細胞功能障礙，其特征是脾臟T細胞凋亡，分化抗原4叉頭翼狀螺旋轉錄因子調節性T細胞（CD4 FoxP3 Tregs）升高，Th1免疫反應抑制[7]，高水平的T淋巴細胞凋亡不僅導致大量免疫效應細胞的丟失，而且會激活多種信號通路，導致機體內免疫系統受到明顯抑制，因此減少T淋巴細胞的凋亡可以改善機體的免疫功能，提高膿毒癥患者的生存率[8]。既往研究表明脾臟中淋巴細胞凋亡狀況與炎癥的嚴重程度和預后密切相關[9]，28 d內死亡的膿毒癥患者外周血淋巴細胞凋亡百分比明顯高于存活患者，死亡患者體內淋巴細胞計數明顯低于存活患者[10]。

多種凋亡途徑最終激活凋亡執行分子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3），Caspase-3在正常情況下以酶原的形式存在，當細胞發生凋亡時，Caspase-3會被活化成為Cleaved Caspase-3，發揮促進細胞凋亡的作用[11]。Ibrahim等[12]通過實驗證明盲腸結扎穿孔術后的大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、NF-κB水平升高，凋亡介質Caspase-3和p-JNK蛋白表達上調，通過非布索坦治療后，各測量參數均有明顯好轉，此外，還能改善組織病理變化，提高整體存活率。本實驗中，小鼠腹腔注射LPS，刺激后3 d小鼠脾臟淋巴細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平高于對照組，而給予人參皂苷Rg3灌胃處理組小鼠的Cleaved Caspase-3蛋白表達水平低于LPS組，提示人參皂甙Rg3有減少小鼠膿毒癥時淋巴細胞凋亡的作用。

既往研究發現人參皂苷Rg3能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路調節線粒體自噬，改善線粒體功能障礙，保護膿毒癥引起的細胞和器官損傷[13]。人參皂苷Rg3能通過NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路發揮強抗炎效果，抑制一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶、環氧化酶-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達[2]。

綜上所述，本實驗通過檢測人參皂苷Rg3對膿毒癥小鼠炎性因子及Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響，提示人參皂苷Rg3具有降低膿毒癥小鼠炎性因子水平、脾臟指數及凋亡相關蛋白Caspase-3活化水平的作用。本研究為動物實驗，存在一定的局限性和不足之處，為進一步探討其機制需進一步深入研究，同時在臨床上的有效性需要通過臨床試驗去驗證。