胃腺癌的關鍵基因及通路的生物信息學分析

孫銘博 陳水兵

胃癌是全球第二大常見腫瘤，胃腺癌占胃癌的95%[1]。作為最常見的胃癌類型，胃腺癌造成了重大的公共衛生負擔，其5年總生存率不到20%[2-3]。胃腺癌的靶向治療主要包括抗人表皮生長因子受體2治療、抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療和抗成纖維細胞生長因子受體治療等；然而，由于不良反應，這些藥物在臨床上應用受到一定限制[4]。鑒于胃腺癌的高發病率和高病死率，迫切需要開發新的治療藥物和治療策略。

近年來，生物信息學在疾病發生、發展的機制研究以及臨床診斷與治療中發揮著越來越重要的作用[5]。轉錄組測序等方法可通過篩選差異表達的基因，發現病理狀態下的基因轉錄差異，找出新的生物標志物，應用于臨床的診斷與治療[6]。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）項目納入了數千個腫瘤樣本的測序結果以及生存期等數據[7]。本研究中，通過將基因轉錄組數據集與生物信息學分析相結合，從而明確胃腺癌組織中基因的表達水平變化，確定存在于差異表達基因的相互作用網絡中的關鍵基因和通路，并在TCGA數據庫中探索其與患者預后的關系，最后通過細胞實驗進行初步驗證。

1 材料和方法

1.1 胃腺癌差異表達基因篩選 以“胃腺癌”為關鍵詞在高通量基因表達（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫中篩選表達譜數據，獲取轉錄組數據集GSE103236、GSE79973、GSE54129和GSE118916。其中GSE103236數據集中包含10例胃腺癌組織樣本和9例正常組織樣本，GSE79973數據集中包含10例胃腺癌組織樣本和10例正常組織樣本，GSE54129數據集中包含111例胃腺癌組織樣本和21例正常組織樣本，GSE118916數據集中包含15例胃腺癌組織樣本和15例正常組織樣本。通過在線工具BioJupies軟件分析上述GSE103236、GSE79973和GSE54129數據集獲得差異表達基因。

1.2 生物學富集和信號通路富集分析 使用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對獲得的差異表達基因進行功能注釋，并進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。GO分析可以明確差異表達基因在生物過程、分子功能和細胞組分的生物學特性[8]；KEGG分析進一步明確差異表達基因在信號通路的富集情況。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建使用STRING數據庫[9]（https://string-db.org/）構建差異表達基因的PPI網絡，并使用Cytoscape進行可視化。通過CytoHubba插件進行關鍵基因的分析，采用Degree算法篩選出PPI網絡中連結度最高的前10個關鍵差異表達基因。這些關鍵基因編碼的蛋白質可能與其他蛋白質具有高度相互作用，并處于PPI網絡的中心位置。

1.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用GSEA軟件對GSE118916數據集進行分析，以確定與胃腺癌相關的生物過程，分子特征數據庫（MSigDB）作為參考基因集[10]。

1.5 總體生存分析 從TCGA數據庫獲取胃腺癌患者臨床信息的數據[11]。使用survminer R包分析這些生物標志物基因與胃腺癌患者預后之間的關聯，分別比較這些關鍵基因高表達組與低表達組患者的總生存期（overall survival，OS）的差異。

1.6 細胞與藥物試劑 本研究使用的MKN45細胞系購自中國科學院上海細胞庫。5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）購自美國MCE公司，UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScript?RT Master Mix購自日本TAKARA公司。

1.7 細胞培養 將MKN45細胞系置于37℃，含有5%CO2細胞培養箱中，使用含有10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基培養。當細胞生長至融合度約60%以上時，添加5-Fu[溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）]或DMSO（對照），處理48 h后提取總RNA并進行實時定量PCR分析。

1.8 Ⅰ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅰ alpha1，COL1A1）、Ⅳ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅳ alpha1，COL4A1）、血小板反應蛋白 1（thrombospondin 1，THBS1）、纖維連接蛋白1（fibronectin 1，FN1）和半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）mRNA表達水平檢測 采用實時定量PCR法。使用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取MKN45細胞的總RNA提取。使用PrimeScript?RT Master Mix逆轉錄RNA為cDNA，并進行實時定量PCR反應。反應條件為：95℃10 min預變性；95℃10 s，60℃30 s，40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，具體引物序列見表1。

1.9 統計學處理 采用Graphpad Prism 8.3.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選 通過BioJupies軟件對GSE103236、GSE79973和GSE54129數據集進行分析，與正常組織樣本相比，胃腺癌組織樣本中分別有289、576和763個差異表達基因，其中有205個是3個數據集共有的，包括顯著下調44個，顯著上調161個。前40個共有差異表達基因熱圖見圖1。

2.2 差異表達基因的生物學富集分析和信號通路富集分析 GO分析結果表明，在生物學過程方面，差異表達基因主要富集在消化過程、細胞外基質形成、膠原分解代謝過程和細胞黏附等生物學過程；在細胞成分方面，差異表達基因主要富集在細胞外間隙、蛋白質細胞外基質、外泌體和細胞器膜部分；在分子功能方面，差異表達基因主要富集在細胞外基質結構成分、細胞外基質結合、肝素結合和單加氧酶活性視黃醇脫氫酶活性，見圖2。KEGG分析顯示有18條顯著富集的信號通路，主要集中在細胞色素P450對異生物質的代謝（hsa00980）、化學致癌作用（hsa05204）、藥物代謝-細胞色素P450（hsa00982）、細胞外基質-受體相互作用（hsa04512）、視黃醇代謝（hsa00830）、蛋白質消化吸收（hsa04974）和胃酸分泌（hsa04971）等信號通路，見圖3。

2.3 PPI網絡構建和關鍵基因的識別 差異表達基因的PPI網絡見圖4。使用CytoHubba插件篩選差異表達基因中的關鍵基因，共得到9個關鍵基因：COL1A1、Ⅱ型膠原 α1亞基（collagen type Ⅰ alpha2，COL1A2）、COL4A1、Ⅵ型膠原 α3亞基（collagen type Ⅵ alpha3，COL6A3）、THBS1、血小板反應蛋白 2（thrombospondin 2，THBS2）、雙糖鏈蛋白多糖（biglycan，BGN）、FN1和SPARC，關鍵基因的PPI網絡見圖5。這些關鍵基因及其對應的蛋白質可能在胃腺癌的發生、發展中發揮重要的調控功能。

2.4 對GSE118916數據集進行GSEA 通過比較胃腺癌組織樣本和正常組織樣本，結果發現與胃腺癌相關的基因主要富集在細胞外基質-受體相互作用通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、p53信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路和視黃醇代謝通路等信號通路，與KEGG結果基本一致，見圖6。

2.5 9個關鍵基因高表達組和低表達組患者OS比較 通過對TCGA數據庫中前述9個基因表達不同的患者進行OS比較，結果顯示COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC高表達組患者OS均短于低表達組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖7。

2.6 細胞實驗驗證關鍵基因 對MKN45胃腺癌細胞系使用5-Fu處理48 h后，COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC等基因表達水平均降低，表明通過5-FU治療后可降低COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC的表達，可能與患者預后改善有關，見圖8。

3 討論

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，預后較差，我國胃癌患者5年生存率低于40%[12]。目前已經發現了很多與胃癌發生、發展相關的基因，這些基因往往與特定的腫瘤組織學類型有關[13]。胃癌在組織學上分為腺癌、腺鱗癌、鱗狀細胞癌、未分化癌和類癌。胃腺癌是胃癌最常見的組織學類型，占所有病例的95%，發病率和病死率較高。胃腺癌患者臨床確診時多為中晚期，術后轉移復發率較高。化療雖能幫助部分患者改善生活質量，延長生存時間，但效果有限[14]。因此，迫切需要基于轉錄組數據的生物信息學分析來了解胃腺癌的分子基礎，為進一步尋找新的治療靶點提供思路。本研究表明，通過生物信息學分析，5個關鍵基因高表達與胃腺癌患者預后差相關，并且與數據庫有較好的一致性。因此，COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC與可作為胃腺癌臨床診斷和預后的新生物標志物。

本研究中，通過BioJupies對GEO數據庫的3個轉錄組數據集 GSE103236、GSE79973和 GSE54129，共131例胃腺癌組織樣本和40例正常組織樣本進行分析，篩選出205個共有的差異表達基因。對205個共有的差異基因進行GO富集分析和KEGG分析，這些差異基因主要富集在消化過程、細胞外基質形成、膠原分解代謝過程和細胞黏附等生物學過程，以及細胞色素P450對異生物質的代謝、化學致癌作用和藥物代謝-細胞色素P450等信號通路上。在對GSE118916數據集進行GSEA分析后，結果表明，胃腺癌組織樣本的差異表達基因主要富集在細胞外基質-受體相互作用通路、mTOR信號通路、p53信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路和視黃醇代謝通路，與KEGG分析的結果一致。同時，對差異表達基因構建了PPI網絡，發現COL1A1、COL1A2、THBS2、COL6A3、COL4A1、BGN、THBS1、FN1和SPARC是該網絡的關鍵基因。為了確定這些關鍵基因的表達高低與患者預后的關系，在TCGA數據庫中胃腺癌患者中進行對比。最后，確定了5個與胃腺癌預后不良相關的關鍵基因：COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC。臨床中常用5-FU治療胃腺癌患者，可使腫瘤組織減小，遷移和增殖降低。因此，對MKN45細胞系進行5-FU處理48 h后，檢測COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC mRNA的表達，結果顯示 COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1、SPARC mRNA的表達均有明顯降低。

COL1A1是Ⅰ型膠原蛋白的pro-α1鏈，作為細胞外基質的重要組成部分，參與許多生物過程，包括細胞外基質重塑、腫瘤細胞黏附和細胞遷移[15]。腹腔注射COL1A1可加速卵巢癌的腹膜內轉移[16]。此外，干擾COL1A1可抑制腫瘤增殖和轉移[17]。COL4A1也是細胞外基質的重要組成部分之一，也參與細胞外基質受體相互作用和黏著斑通路，并在血管生成、炎癥和腫瘤進展中發揮重要作用[18]。有研究表明，COL4A1在曲妥珠單抗耐藥的胃腺癌細胞中高表達[19]。THBS1表達與腫瘤血管生成、腫瘤生長和轉移相關[20]。在胃腺癌中，由于THBS1與VEGF呈正相關，可能起到促血管生成和促炎作用，并且THBS1表達水平升高與胃腺癌中的腫瘤生長和淋巴結轉移相關[21]。越來越多的細胞檢測表明THBS1在腫瘤細胞的侵襲和遷移中發揮著重要的作用。FN1是一種高分子量（440 kDa）的細胞外基質細胞黏附糖蛋白，主要在各種癌組織中表達[22]，參與細胞外基質受體相互作用、細胞黏附通路、癌癥通路和內皮細胞存活、增殖、黏附、遷移、炎癥和血管生成。有研究表明，在胃腺癌組織中抑制FN1的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[23]。SPARC在不同的腫瘤組織中表達有所不同。在惡性胸膜間皮瘤中，腫瘤細胞和腫瘤基質細胞均表達較高。血清SPARC水平升高往往預示著患者預后不良[24]。在不同腫瘤中，SPARC的來源并不相同。在惡性卵巢癌、結直腸癌和胃癌患者中，SPARC主要來自腫瘤基質細胞[25]。在黑色素瘤和乳腺癌患者中，腫瘤細胞是SPARC的主要來源[26]，但在胃腺癌的研究中尚不明確。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法分析了胃腺癌發展的分子機制，確定了5個關鍵基因：COL1A1、COL4A1、THBS1、FN1和SPARC，并通過細胞實驗做了初步驗證。然而，還需要進一步的分子生物學實驗來驗證這些關鍵基因在腫瘤發生、發展中的作用。